| 研究課題/領域番号 |
15K08625
|
|---|
| 研究機関 | 帝京大学 |
|---|
研究代表者 |
藤原 優子 帝京大学, 薬学部, 助教 (70722320)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | スフィンゴ糖脂質 / LC-ESI-MS / ペルオキシソーム病 / スフィンゴリピドーシス / キラルカラム |
|---|
| 研究実績の概要 |
元来の28年度の研究計画は「実験動物を用いた組織におけるスフィンゴ糖脂質の網羅的解析、およびヒトペルオキシソーム病患者サンプルのスフィンゴ糖脂質解析」を目標に掲げた。しかし、27年度より行っていた液体クロマトグラフィーの分離系の検討に予想以上の時間がかかった為、28年度のほとんどは液体クロマトグラフィーの分離系の検討に費やした。これまでは糖脂質の分離はC18逆相カラムで行うのが一般的であったが、この条件では疎水部での分離は可能であるが、親水基が違う糖脂質もほぼ同時に溶出される傾向にあり、糖脂質の網羅的解析はほとんどなされていない。よって、疎水部での分離を保持したまま、親水部での分離も可能な条件を模索するためにキラルカラムによる分離の検討を行った。ダイセルよりレンタル可能な6種類のキラルカラムを試し、従来用いられてきたC18逆相カラムより疎水部のみならず、親水部での分離、感度が良いキラルカラムIF-3を見出すことができた。その後、それぞれの糖脂質の標品を用いて、このカラムにおける最適なLC-MS/MS解析条件の検討を行った。キラルカラムを用いて確立したLC-MS/MS解析条件をまとめ、投稿論文を書いているところである。また、確立したLC-MS/MS解析条件を用いて、HeLa細胞の野生株およびABCD1遺伝子ノックアウト細胞より抽出した生体サンプルにおけるスフィンゴ糖脂質の測定を行い、解析を行っている段階である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
解析対象である糖脂質は多くの脂質クラスがあることに加え、セラミド部分の脂肪酸、スフィンゴイド長鎖塩基のバリエーションが多様であることから、網羅的な解析を行えるようにするためにはカラムによる分離を詳細に検討することが重要と考え、これまでカラムの検討を重点的に行ってきた。このカラムの検討に予想以上の時間がかかったが、結果として、従来用いられてきたカラムより分離および感度の良いカラムが見つかった。今後はこのカラムで、生体サンプルを用いた解析に進んで行く予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
これまでに確立したキラルカラムを用いたLC-MS/MSによる分離測定系のデータをまとめ、投稿論文を書いているところである。近いうちにこれを完成させ、結果を投稿する予定である。また、これまでに生体サンプルとして、HeLa細胞からのメタノールによる脂質抽出を試しているが、クロロホルムーメタノール混合溶媒による抽出方法ほか、イソプロパノールーヘキサンー水系、固相抽出、二酸化炭素による超臨界抽出方法も検討する予定である。また、副腎白質ジストロフィーモデルであるALDPノックアウトマウスの各臓器から糖脂質を抽出し、糖脂質の網羅的解析を行う実験にも着手する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
分離系を検討するために多くのカラムの購入を考慮して使用額を控えていたが、検討カラムの多くはレンタル品として提供してもらえたので、最終的購入カラムは少なく抑えられたので、その差額が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
生体サンプルが限られているため、多くの場合はそれぞれの糖脂質の標品を用いて実験する。よって今後はこの標品の購入に充てる。 また、定量解析をするためには、内部標準と呼ばれる安定同位体試料が必要になる。必要な安定同位体試料が販売されていない場合は、カスタム作製になるため高額になる。よって、残金の多くはこれらの購入に充てる予定である。
|
