| 研究課題/領域番号 |
15K08629
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| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
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研究代表者 |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| 研究分担者 |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (80572966)
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 抗体 / 変異抗体 / バイオマーカー / 進化分子工学 / ファージ提示 / パンニング / デジタル検出 / マイクロアレイ |
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| 研究実績の概要 |
疾患バイオマーカーを認識・捕捉する抗体は、その検査法を確立するうえで強力なツールになる。現在、診断用抗体は主にハイブリドーマ法で調製されているが、その機能を遺伝子操作により改善することができる。抗体のH鎖およびL鎖可変部の遺伝子にランダム変異を加えた後に一本鎖Fvフラグメント (scFv) の遺伝子に変換し、適当な宿主内で発現させて莫大な多様性をもつ変異scFvの「ライブラリー」を調製し、偶然に生成した改良型分子種を選択・単離する。その効率を高めるために、scFvを繊維状バクテリオファージ粒子の表面に発現させて「scFv提示ファージ」のライブラリーを作製し、ごく希少な改良型分子種を、大量に副生する「改悪分子種」から選別しつつ単離する。具体的には、目的の抗原を固定化した固相にファージライブラリーをまとめて反応させて、非特異的なファージを洗浄・除去した後に、特異的なファージを溶出・回収する (この手法を「パンニング」と呼ぶ)。以上の原理と実験系は既に確立され、天然の抗体を遥かに上回る変異抗体を創出しうる革新的な方法と期待されてきた。しかし、現実にはそのような水準に程遠い。パンニングによる改良型クローンの選別効率の悪さがその主因である。我々は、この問題を抜本的に解決するために、scFv提示ファージのクローニングと選択を同時に行う新たな方法を考案し、その確立を検討している。申請調書には理想的な方法を記載したが、その後、より実現性の高い方法に変更した。すなわち、ファージそのものではなく、これからファージを産生するヘルパーファージ感染菌の段階でマイクロウェルにクローニングして培養し、個々のウェル内に蓄積されたファージの目的抗原への結合能をELISAと同様の原理で検出するものである。この1年間に、種々の基礎検討を進めてきたが、その詳細は、以下の「現在までの進捗状況」の項に詳述する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ファージ提示変異抗体ライブラリーから疾患バイオマーカーを認識する高性能抗体を単離するうえで、在来の「パンニング」では限界があり、選択効率の抜本的な改革が切望される。そこで、改良抗体分子を提示するファージをデジタル検出する新規な選択・単離法の開発を進めている。現在、調書に記載した「方法I」のマイクロアレイの原理に基づく戦略の可能性を検討している。すなわち、変異抗体 [(実際は一本鎖Fvフラグメント(scFv)] の遺伝子を導入した大腸菌ライブラリーにヘルパーファージを感染させた後に、感染菌の培養液を多数のマイクロウェルに分散・播種していく方法である。感染菌はウェル内でscFvファージを産生するが、目的抗原に特異的なscFvならば予めウェルにコーティングされた抗原に捕捉され、洗浄後に標識抗ファージ抗体により検出される。これまでに、陽性ウェルを特定するうえで十分な検出感度を得るために、(1)反応の場は96ウェルプレートであることが必要で、現状では384ウェルプレートでは不可能なこと、(2)1感染菌/ウェルで播種するのが理想的であるが、実際には約10感染菌/ウェルで播種する必要があること、(3)培養液を溶媒としても固相上の抗原とscFv提示ファージの間で抗原抗体反応が起こること、(4)1感染菌あたりの陽性ファージの産生量は大腸菌TG1/KM13ヘルパーファージの組み合わせが優れていること、などを明らかにした。また、固相上に捕捉されたファージの検出に必要なモノクローナル抗ファージ抗体をハイブリドーマ法により作製した。さらに、そのH鎖とL鎖の可変部遺伝子をクローニングしてscFv遺伝子を構築し、カイアシ由来のルシフェラーゼ GLucの遺伝子と連結した。この遺伝子の産物である抗ファージscFv-GLucを用いる生物発光法により、10e6ビリオン/ウェルのファージを検出することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のように、改良抗体分子を提示するファージをデジタル検出する新規な選択・単離法を構築するうえで、必須となる要件が成立すること確認し、必要な試薬などを整えることができた。次の段階は、この方法を実践し、従来は単離が困難だった高性能変異scFv (例えば、多様性の大きなscFvライブラリーに含まれるごく少数の高親和力scFv) を格段に容易に単離できることを実証することである。そのためのモデルライブラリーとして、申請者らが作製した抗エストラジオール (E2) 変異scFvのライブラリーを利用する。我々は、先にマウス抗E2抗体の可変部ドメインを連結して作製した「野生型」scFvに3段階の点変異導入と従来のパンニングによる選択を行い、E2に対する結合定数が野生型に比べて150倍も強い変異scFv (「チャンピオンクローン」とする) を単離することに成功した。ただし、各段階で「ベストクローン」を単離するまでに、平均数カ月に及ぶ候補クローンのスクリーニングを要している。最終的に選んだチャンピオンクローンでは計11箇所にアミノ酸の置換が認められたが、最近の検討の結果、そのうち4つの置換のみでその親和力の増強は決定づけられることが判明している。そこで、その4箇所をランダム化したミニライブラリーを作製し、これを我々の新規選択・単離法と在来のパンニングとで検索し、必ず含まれているはずのチャンピオンクローンを得るうえでの効率を比較する。改良法では、数回のトライアルのうちにこれを得ることができるものと期待している。この試験により有用性が実証された場合、より大きな多様性を持つ実際の変異scFvライブラリー (例えばH鎖相補性決定部CDR3にランダム変異を導入したもの) に応用し、未知の高性能scFvの単離を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ、予定通りの支出であったが、残額が少なくなり、必要な物品を購入するには足りなくなったため、次年度使用することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
必要な試薬の購入に使用する。
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