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2015 年度 実施状況報告書

検体中の生菌数を感染症重症度や治療効果の新たな指標とする検査技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号 15K08642
研究機関富山大学

研究代表者

仁井見 英樹  富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)

研究分担者 北島 勲  富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
野手 良剛  富山大学, 大学病院, 臨床検査技師長 (60377364)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード敗血症 / 遺伝子検査 / 迅速検査 / 起炎菌の定量 / Viability PCR
研究実績の概要

本年度、我々はViability PCRを臨床応用し、患者検体中のMRSAを高感度で検出且つ生菌・死菌の判別を行うことで、MRSAに対する抗菌薬治療の効果をモニタリングできるようにして、MRSA感染症の治療に役立つ新たな検査を構築することを目的とした。

方法ならびに成績
本研究ではmecA遺伝子を標的としたnested PCR法を工夫した。mecA遺伝子を標的とすることで、MRSEのみならず、methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE)や、methicillin-resistant Coagulase-negative Staphylococci (MRCNS)等、全てのメチシリン耐性菌を検出することが出来る。また、nested PCRを用いることで、高感度・高特異度の菌検出(LOD=8.1 CUF/mL)を行い、安定的なCt (Cycle threshold) valueが得られるようにした。更に、mecAプライマーは50サイクルまでdimerが生じないように設計し、no amplification(=死菌)を正確に確認できるようにした。
先ずViability PCRの性能評価を行うために、in vitroで抗菌薬(gentamicin, vancomycin, linezolid)のMRSAに対する効果判定を24時間、および12日間で行った。その結果、8時間後にvancomycinの感受性が確認でき、また、vancomycin投与6日目には全ての菌が死滅したことを正確に判定できた。次に臨床血液検体11検体を用い、Viability PCRの評価を行った。その結果、全てのMRSAが全て死菌である(= no amplification)と判定した検体は、培養法でもコロニーが生じなかった。但し、患者検体中(in vivo)での低濃度域のCt differenceの値は不安定であり、現プロトコールにおいて、抗菌薬の効果を定量的に判定するのは難しいことが分かった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Viability PCRの臨床検体への応用についてはMRSAをターゲットとして検査系を構築し、実際に患者血液検体で試験運用を行った。その結果、実際の患者検体でのPMA試薬の使用は効果が不安定であり、現プロトコールではfalse-negativeの危険性が避けられないことが判明した。この点を見極めるために、今後はより検出感度を高めたプロトコールに改めて、再度の評価を行う計画である。
その他、定量検査のプロトコールは細部まで最適化を行い、生菌・死菌の判定を行わないのであれば、正確な起炎菌の定量検査が行えるところまで達成できた。

今後の研究の推進方策

メチシリン耐性菌を標的としたViability PCRの報告は今迄に無く、また、臨床検体から直接、生菌・死菌を判定するViability PCRの臨床応用も未だ報告されていないため、本研究は臨床におけるViability PCRの初の挑戦的な試みである。患者検体中の微量な菌においてはCt valueが安定しないため、現時点では菌が完全に死滅したことの判定は可能と考えるが、生菌・死菌の割合を定量的に測定するには、感度を高めるなどのプロトコールの更なる改良が必要である。
今後は「生菌・死菌の判定」と「患者検体中の起炎菌の定量測定」を2つに分けて、それぞれを異なる達成目標として研究をすすめる。起炎菌の定量測定方法は概ね確立できたので、今後は患者検体で検証していく予定である。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2016 2015 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Antibiotic Therapy Increases the Risk of Preterm Birth in Preterm Labor without Intra-Amniotic Microbes, but may Prolong the Gestation Period in Preterm Labor with Microbes, Evaluated by Rapid and High-Sensitive PCR System2016

    • 著者名/発表者名
      Yoneda S, Shiozaki A, Yoneda N, Ito M, Shima T, Fukuda K, Ueno T, Niimi H, Kitajima I, Kigawa M, Saito S
    • 雑誌名

      American Journal of Reproductive Immunology

      巻: 75(4) ページ: 440-50

    • DOI

      10.1111/aji.12484

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Eukaryote-Made Thermostable DNA Polymerase Enables Rapid PCR-Based Detection of Mycoplasma, Ureaplasma and Other Bacteria in the Amniotic Fluid of Preterm Labor Cases2015

    • 著者名/発表者名
      Ueno T, Niimi H, Yoneda N, Yoneda S, Mori M, Tabata H, Minami H, Saito S, Kitajima I.
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: 10(6):e0129032. ページ: 1-17

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0129032

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Melting Temperature Mapping Method: A Novel Method for Rapid Identification of Unknown Pathogenic Microorganisms within Three Hours of Sample Collection2015

    • 著者名/発表者名
      Niimi H, Ueno T, Hayashi S, Abe A, Tsurue T, Mori M, Tabata H, Minami H, Goto M, Akiyama M, Yamamoto Y, Saito S and Kitajima I
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 5 12543 ページ: 1-13

    • DOI

      10.1038/srep12543

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Polymicrobial Amniotic Fluid Infection with Mycoplasma/Ureaplasma and Other Bacteria Induces Severe Intra-Amniotic Inflammation Associated with Poor Perinatal Prognosis in Preterm Labor2015

    • 著者名/発表者名
      Yoneda N, Yoneda S, Niimi H, Ueno T, Hayashi S, Ito M, Shiozaki A, Urushiyama D, Hata K, Suda W, Hattori M, Kigawa M, Kitajima I, Saito S.
    • 雑誌名

      American Journal of Reproductive Immunology

      巻: 75(2) ページ: 112-25

    • DOI

      10.1111/aji.12456

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] 血液検体からの起炎菌の直接検出・同定方法の開発2015

    • 著者名/発表者名
      仁井見 英樹
    • 雑誌名

      化学療法の領域 増刊号

      巻: 31(S-1) ページ: 211-219

  • [雑誌論文] ジャーナルトピックス CHIPS法(遺伝子変異スクリーニング法)は遺伝子検査の簡便化・低コスト化に役立つ2015

    • 著者名/発表者名
      仁井見 英樹
    • 雑誌名

      臨床化学

      巻: Vol.44(No.4) ページ: 326-326

  • [学会発表] Melting Temperature (Tm) mapping法:検体採取後3時間以内での敗血症起炎菌迅速同定法2015

    • 著者名/発表者名
      仁井見 英樹
    • 学会等名
      第58回日本感染症学会中日本地方会学術集会
    • 発表場所
      奈良
    • 年月日
      2015-10-16 – 2015-10-16
  • [学会発表] Tm mapping 法:血液検体からの起炎菌の直接検出・同定方法の開発2015

    • 著者名/発表者名
      仁井見 英樹
    • 学会等名
      第27回臨床微生物迅速診断研究会総会
    • 発表場所
      金沢
    • 年月日
      2015-07-04 – 2015-07-04
    • 招待講演
  • [学会発表] Tm mapping法(感染症起炎菌迅速同定法)の院内試験運用結果と正確性の評価2015

    • 著者名/発表者名
      仁井見 英樹
    • 学会等名
      第89回日本感染症学会学術講演会
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      2015-04-16 – 2015-04-16
  • [備考] 富山大学研究者総覧

    • URL

      http://evaweb.u-toyama.ac.jp/html/405_ja.html

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公開日: 2017-01-06  

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