高齢者白血病細胞の脂肪酸代謝制御マーカーの探索と代謝・転写メカニズムの解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K08653
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 田部 陽子 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70306968)
• 研究分担者: 三井田 孝 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80260545)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 脂肪酸代謝 / 急性骨髄性白血病 / 骨髄脂肪細胞 / 骨髄微小環境 / アポトーシス

研究実績の概要

本研究は、高齢者骨髄（黄色髄 / 脂肪髄）内で生き残り、治療後再発を多く認める急性骨髄単球性白血病(AMoL)をモデルとして、AMoL細胞中の脂肪酸代謝が、遺伝子転写や生存シグナル活性化に果たす役割を解明することを目的とする。
当該年度の研究では、骨髄脂肪細胞がAMoL細胞に対して抗アポトーシス効果を発揮することを確認した上で、骨髄脂肪細胞との相互作用によってAMoL細胞内で生じる遺伝子転写（核内）と脂肪酸代謝（ミトコンドリア内）の変化について検討した。その結果、骨髄脂肪細胞と共培養したAMoL細胞において (1)細胞周期抑制を伴うアポトーシス抵抗性を認めること、(2) ROS産生が抑制されること、(3)ケトン体産生が亢進すること、(4) 脂肪酸をリガンドとする核内受容体PPARg遺伝子、PPARgの標的遺伝子であるCD36 (脂肪酸scavenger受容体)遺伝子、FABP4 (脂肪酸輸送蛋白)遺伝子、脂肪酸のミトコンドリア取り込みを制御するCPT-1遺伝子、抗アポトーシスBCL2遺伝子、等の発現が亢進することが明らかになった。
これらの知見は、脂肪細胞が増生した高齢者の骨髄中においてAMoL細胞の生存が脂肪酸代謝に強く依存していることを示唆するものである。次年度以降の研究により、高齢者の骨髄中に存在する白血病細胞のがん代謝制御マーカーを同定し、がん細胞特有の代謝を標的とした副作用の少ない効果的な治療アプローチを提案する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の研究には、AMoL細胞株（U937, THP1, MOLM13, MV4;11, OCI-AML3）およびインフォームドコンセントを得て採取した患者由来AMoL細胞と正常ヒト骨髄間質系幹細胞 (mesenchymal stem cell; MSC）およびMSCから分化誘導した骨髄脂肪細胞を用いた。AMoL細胞に対して血清非添加条件でアポトーシスを誘導し、これらがMSCや骨髄脂肪細胞との共培養で抑制されるか否かを調べた。同時に遺伝子転写、脂肪酸代謝、ミトコンドリアにおける活性酸素 (ROS) 産生に及ぼす影響についても検討を加えた。
その結果、骨髄脂肪細胞の存在下でAMoL細胞内への脂肪酸の取り込みとミトコンドリアでの脂肪酸β酸化（FAO）が亢進することを明らかにするとともに、AMoL細胞に取り込まれた脂肪酸そのものが、核内受容体PPARgの転写活性を亢進させ、脂肪酸の細胞内輸送やミトコンドリア内への取り込みに関与する遺伝子の転写を活性化することを示すことができた。これによって、まず、脂肪酸代謝と遺伝子転写との明確な関連性が明らかになった。また、CD36については、骨髄脂肪細胞の存在下のAMoL細胞で、遺伝子発現のみならず、細胞表面での受容体としての発現レベルにおいても有意に上昇することが確認できた。CD36は細胞表面マーカーとして検出可能であり、今後の検査指標としての可能性を示唆するものである。一方、脂肪酸代謝マーカーとして測定したカルニチンの分泌濃度は骨髄脂肪細胞との共培養前後で変化を認めず、検査指標としての有用性は否定的と考えられた。
以上より、本年度は、当初予定通りの達成度が得られた。

今後の研究の推進方策

今後の研究では、骨髄脂肪細胞との共培養下でのAMoL細胞に対する脂肪酸代謝阻害剤のアポトーシス効果を検証する。これによって、AMoL細胞が獲得した抗アポトーシス能が、脂肪酸β酸化（FAO）依存性であることを証明する。また、FAO阻害剤によって生じる細胞内シグナルの活性変化を検出する。
研究の推進方策としては、骨髄脂肪細胞によるアポトーシス抑制効果が強く認められたAMoL細胞株について、FAO阻害剤（Etomoxir）を用いて骨髄脂肪細胞によるアポトーシス抑制効果の消失を確認する。さらに、その際のAMoL細胞の脂肪酸代謝の変化 (FAO促進とROS抑制) を酸素消費量、乳酸産生量、ミトコンドリア膜電位変化の検出等により検出する。同時に、培養液上清中の脂肪酸、ケトン体量の変化（ELISA）を調べる。
また、CETOF-MSシステム (Agilent Technologies)を用いてAMoL細胞内の代謝変化を網羅的に測定する。さらに次の段階として、骨髄脂肪細胞との共培養およびFAO阻害剤使用後のAMoL細胞株の遺伝子転写プロファイルの変化をRNA-seqおよびcap analysis of gene expression (CAGE)解析により検出する（Hiseq 2000, illumina）。
最終的には、AMoL細胞の生存に関わる脂肪酸代謝 - 転写 - 細胞シグナルネットワークを抽出、標的マーカー候補を選択し、siRNAを用いたノックダウン試験により機能解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

検討項目の実施順位を変更し、骨髄脂肪細胞との共培養によるAMoL細胞表面のCD36発現量の変化（フローサイトメトリー）、培養液上清中の脂肪酸、FABP4、カルニチン量の変化（ELISA）の検出を本年度に実施し、CETOF-MSシステムによる代謝変化の網羅的測定、RNA-seq解析による遺伝子転写プロファイルの変化の検出を次年度以降に実施することとしたことによって次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

CETOF-MSシステムによる代謝変化の網羅的測定、RNA-seqおよびcap analysis of gene expression (CAGE)解析による遺伝子転写プロファイルの変化の検出、iTRAQプロテオーム解析を次年度以降、実施する。次年度使用額は、翌年度分として請求した助成金と合わせてこれらの実験に使用する。

研究成果

• [国際共同研究] MDAnderson Cancer Center(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: MDAnderson Cancer Center
• [雑誌論文] ATF4 induction through an atypical integrated stress response to ONC201 triggers p53-independent apoptosis in hematological malignancies. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ishizawa J, Kojima K, Chachad D, Ruvolo P, Ruvolo V, Jacamo RO, Borthakur G, Mu H, Zeng Z, Tabe Y, Allen JE, Wang Z, Ma W, Lee HC, Orlowski R, Sarbassov dos D, Lorenzi PL, Huang X, Neelapu SS, McDonnell T, Miranda RN, Wang M, Kantarjian H, Konopleva M, Davis RE, Andreeff M.
  • 雑誌名: Sci Signal. 巻: 9 ページ: ra17
  • DOI: 10.1126/scisignal.aac4380.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Role of microenvironment in resistance to therapy in AML. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tabe Y, Konopleva M.
  • 雑誌名: Curr Hematol Malig Rep. 巻: 10 ページ: 96, 103
  • DOI: 10.1007/s11899-015-0253-6.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ribosomal Biogenesis and Translational Flux Inhibition by the Selective Inhibitor of Nuclear Export (SINE) XPO1 Antagonist KPT-185. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tabe Y, Kojima K, Yamamoto S, Sekihara K, Matsushita H, Davis RE, Wang Z, Ma W, Ishizawa J, Kazuno S, Kauffman M, Shacham S, Fujimura T, Ueno T, Miida T, Andreeff M.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 10 ページ: e013720
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0137210.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Expression, function, and targeting of the nuclear exporter chromosome region maintenance 1 (CRM1) protein. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishizawa J, Kojima K, Hail N Jr, Tabe Y, Andreeff M.
  • 雑誌名: Pharmacol Ther. 巻: 153 ページ: 25, 35
  • DOI: 10.1016/j.pharmthera.2015.06.001.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The novel combination of dual mTOR inhibitor AZD2014 and pan-PIM inhibitor AZD1208 inhibits growth in acute myeloid leukemia via HSF pathway suppression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Harada M, Benito J, Yamamoto S, Kaur S, Arslan D, Ramirez S, Jacamo R, Platanias L, Matsushita H, Fujimura T, Kazuno S, Kojima K, Tabe Y, Konopleva M.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 6 ページ: 37930, 37947
  • DOI: 10.18632/oncotarget.6122.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] mTOR kinase inhibitor AZD-2014 enhances the antitumor effects of XPO1 antagonist KPT-185 in mantle cell lymphoma. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kazumasa Sekihara, Shinichi Yamamoto, Mika Kikkawa, Hikari Taka, Naoko Kaga, Hiromichi Matsushita, Takashi Miida, Michael Andreeff, Marina Konopleva, Yoko Tabe
  • 学会等名: European Society for Medical Oncology (ESMO) Asia 2015 Congress
  • 発表場所: Singapore （シンガポール）
  • 年月日: 2015-12-18 – 2015-12-21
  • 国際学会
• [学会発表] Novel FAO inhibitor avocatin B induces apoptosis of acute monocytic leukemia cells in adipocyte co-culture system via ER stress and ATF4 activation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoko Tabe, Shinichi Yamamoto, Mika Kikkawa, Hikari Taka, Naoko Kaga, Kaoru Mogushi, Hiromichi Matsushita, Takashi Miida, Michael Andreeff, Paul A. Spagnuolo6 Marina Konopleva.
  • 学会等名: 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition.
  • 発表場所: Orlando （アメリカ）
  • 年月日: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • 国際学会
• [学会発表] Cap analysis of gene expression (CAGE) sequencing reveals alterations of the transcript signatures in acute monocytic leukemia cells by fatty acid oxidation inhibition (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoko Tabe, Marina Konopleva, Norikazu Monma, Kazuho Ikeo, Kaoru Mogushi, Yasunari Yamanaka, Hiromichi Matsushita, Takashi Miida, Yoshihide Hayashizaki, Michael Andreeff.
  • 学会等名: 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition.
  • 発表場所: Orlando（アメリカ）
  • 年月日: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • 国際学会
• [学会発表] Inactivating Heat Shock Factor 1 (HSF1) in Acute Myeloid Leukemia By Pharmacological Inhibition of eIF4a: A Promising Therapeutic Approach. (2015)
  • 著者名/発表者名: Jo Ishizawa, Rodrigo Omar Jacamo, Kensuke Kojima, Dhruv Chachad, Vivian Ruvolo, Peter Ruvolo, Weiguo Zang, Yoko Tabe, Marina Konopleva, William Devine, Susan Lindquist, John A Porco, Luke Whitesell, Michael Andreeff:
  • 学会等名: 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition.
  • 発表場所: Orlando （アメリカ）
  • 年月日: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • 国際学会
• [学会発表] Combined Targeting of JAK2 with a Type II JAK2 Inhibitor and mTOR with a TOR Kinase Inhibitor Constitutes Synthetic Activity in JAK2-Driven Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia (2015)
  • 著者名/発表者名: Ce Shi, Lina Han, Qi Zhang, Kathryn G. Roberts, Eugene Park, Yoko Tabe, Rodrigo Omar Jacamo, Hong Mu, Shuo-Chieh Wu, Jin Zhou, Helen Ma1, Zhihong Zeng, Nitin Jain, Elias J Jabbour, Markus Muschen1, Sarah K Tasian, Charles G. Mullighan, David M. Weinstock, David Fruman, Marina Konopleva,.
  • 学会等名: 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition.
  • 発表場所: Orlando （アメリカ）
  • 年月日: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • 国際学会
• [学会発表] ONC201 Induces p53-Independent Apoptosis and Abrogates Stem Cell Function in Hematological Malignancies By Induction of ATF4 through Integrated Stress Response (2015)
  • 著者名/発表者名: Ishizawa J, Kojima K, Chachad D, Ruvolo P, Ruvolo V, Jacamo RO, Borthakur G, Mu H, Zeng Z, Tabe Y, Allen J, Wang Z, Ma W, Lee H, Orlowski RZ, Sarbassov DD, Neelapu SS, McDonnell TJ, Miranda RN, Wang M, Kantarjian HM, Konopleva M, Eric Davis R, Andreeff M:
  • 学会等名: 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition.
  • 発表場所: Orlando （アメリカ）
  • 年月日: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • 国際学会