| 研究課題/領域番号 |
15K08684
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
松村 伸治 関西医科大学, 医学部, 講師 (70276393)
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| 研究分担者 |
伊藤 誠二 関西医科大学, 医学部, 教授 (80201325)
西田 和彦 関西医科大学, 医学部, 助教 (80448026)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 疼痛の神経機構 / 多光子励起顕微鏡 / プロスタグランジン |
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| 研究実績の概要 |
我々は、in utero 遺伝子導入法による脊髄神経回路蛍光可視化可能なマウス作製法を確立し、自発呼吸下の個体のin vivo標本において2光子顕微鏡を用いて複数の脊髄後角ニューロンの細胞内Ca2+イメージングを行い、皮膚感覚刺激に応答するニューロンの3次元刺激-応答地図を作製することに成功した。この新技術を用いることにより、神経障害性疼痛に関わる感覚情報伝達神経回路網を構成するニューロンの形態学的変化とその活動変化を同時に高空間・高時間分解能で可視化が可能となった。遺伝的プローブを用いることで目的ニューロン群におけるイメージングが初めて可能となり、脊髄を摘出すること無く観察を可能としたので、生体脊髄で同定したニューロンレベルでのPGE2の役割を解明することは神経障害性疼痛発症維持の可塑性形成機構解明の一助となる。PGE2は疼痛修飾物質として、痛覚のグルタミン酸作動性興奮伝達を促進し、グリシン作動性抑制伝達を減弱して、痛みの中枢性感作に関与していると考えられている。いままで神経障害性疼痛において一次求心性感覚神経のEP1、EP3受容体やグリシン作動性抑制ニューロンのEP2受容体による修飾が関与されているとされているが、実際にその過程を経時的に個体レベルで記録することは出来ていない。
in vivo標本を用いて皮膚への機械的な刺激に反応して細胞内Ca2+濃度増加するニューロンの中にPGE2によってその反応が記録された。そのニューロンは脊髄後角表層に存在した。PGE2が痛覚過敏をひきおこすことを行動実験により我々の研究グループが既に報告しているが、その痛覚過敏行動を引き起こすニューロンの活動を今回記録することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
疼痛モデル動物脊髄ニューロンネットワークの可塑性機構の可視化 神経障害性疼痛の特徴の一つは、触覚刺激が痛覚として知覚されることである。この変調を来す可塑性機構を脊髄ニューロンの刺激-応答地図の中で形態学的、機能的変化として可視化を行っている。長時間にわたり、連続的に形態変化を追跡すると共に、それに伴うCa2+動態変化を記録し、形態と機能の連関の解析を試みている。PGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬を用いてどのような修飾変化が起こるかを観察記録し、EP受容体の役割を詳細に検討するために、in vivo標本で行う前に急性スライス標本により単純な実験系でPGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬の効果を検証した結果、EP2受容体サブタイプに的をしぼりin vivo標本での効果を検証することを予定している。
脊髄ニューロン棘突起における局所刺激応答に対するPGE2の効果 我々はEP3受容体サブタイプのシグナル下流にニューロン構造タンパク質が存在することを示唆した。そこで、脊髄ニューロンのシナプスを形成する棘突起にグルタミン酸等のケージド試薬を局所投与し、オプトジェネティクスによる選択的な刺激を与え、その反応に対するPGE2の役割を検討することを計画したが、多光子励起顕微鏡の特性上観察するためのレーザー波長でオプトジェネティクスによる刺激も引き起こしてしまい、選択的な刺激を与えることが困難であることが判明した。この不具合を解消する方法を検討している。
脊髄腰膨大部におけるPGE2の局在の定量解析 質量顕微鏡は質量分析を２次元的に行うことを可能とし、今までの生化学的手法と異なりPGE2の脊髄腰膨大部での局所的な２次元分布の定量解析を可能とする。しかしながら、PGE2の定量のためには既知のマトリクスではうまく検出できず、現在最適なマトリクスやそのコーティング法を検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
疼痛モデル動物脊髄ニューロンネットワークの可塑性機構の可視化 神経障害性疼痛の特徴の一つは、触覚刺激が痛覚として知覚されることである。急性スライス標本により検討した結果、グルタミン酸刺激に応答するニューロンへのPGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬の効果は、EP2受容体で観察された。脊髄ニューロン特異的にカルシウムプローブタンパクが発現するマウスや抑制性インターニューロン特異的にプローブが発現するマウスを作製することが出来たので、個体レベルのin vivo標本を用いて、神経障害性疼痛において一次求心性感覚神経のEP1、EP3受容体やグリシン作動性抑制ニューロンのEP2受容体による修飾の過程を経時的に記録することを試みる。
脊髄ニューロン棘突起における局所刺激応答に対するPGE2の効果 オプトジェネティクスによる選択的な刺激を与え、その反応に対するPGE2の役割を検討することを計画したが、in vivo標本での観察を可能とする多光子励起顕微鏡の特性上観察するためのレーザー波長でオプトジェネティクスによる刺激も引き起こしてしまい、選択的な刺激を与えることが困難であることが判明した。初代分散培養ニューロンの使用も検討し、ニューロン棘突起を含むシナプスへのPGE2の作用をイメージングすることを試みる。
脊髄腰膨大部におけるPGE2の局在の定量解析 質量顕微鏡を用いたPGE2の定量のために現在最適なマトリクスやそのコーティング法を検討を続け、なんとかPGE2の二次元的定量解析を開始できる等に努力する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
オプトジェネティクスを用いた研究に問題が生じて、予定していたマウスでは効果的な刺激を与えながらの観察ができないことが明らかとなったために、そのマウスの購入ができなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
電気生理学ていな方法の導入を検討し、それに適したオプトジェネティクスを用いた実験を遂行できるマウスを購入する。
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