2016 年度実施状況報告書

若年胆管細胞癌の遺伝的な発症リスクの検証

研究課題

研究課題/領域番号	15K08716
研究機関	大阪市立大学
研究代表者	川村悦史大阪市立大学, 大学院医学研究科, 病院講師 (60419710)
研究分担者	河田則文大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (30271191) 久保正二大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80221224) 村上善基大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (00397556)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	若年 / 遺伝子発現 / 印刷所 / 胆管癌 / 胆管細胞癌
研究実績の概要	印刷所胆管癌の原因化学物質とされるジクロロメタン、1,2-ジクロロプロパンのうち前者および後者（の類似物質）はヒトの胆管上皮細胞に分布する薬物代謝酵素glutathione S-transferase theta 1（GSTT1）により解毒されると考えられている。我々は、GSTT1の遺伝子型のうち非活性型（genotype null）では胆管癌は発症しない、という仮説を立てた。胆管細胞癌は、早期診断が難しく、術後5年生存率は22－44％と予後不良な疾患である。平成24年に大阪市内の印刷会社で起こった化学物質による若年胆管細胞癌に関する報道がなされた。我々は、印刷所胆管細胞癌の発症原因は化学物質の代謝過程にあり、代謝酵素の働きには遺伝的な個人差があると考えている。胆管細胞癌の発症機序を解明する上で印刷所症例と非印刷所症例の比較は有用と考えられる。我々は、平成27年度より若年胆管細胞癌の発症リスクに関して印刷所胆管細胞癌症例を含む肝組織および血清を検体とする解析、（1）若年胆管細胞癌の診断マーカー探索（RNAマイクロアレイによる網羅的解析）、（2）(1)の結果のうち化学物質の代謝酵素と関連するRNAの定量的解析（若年胆管癌細胞の発症機序の推定）を行なうこととした。平成27年度、若年胆管細胞癌の外科的切除検体を使ったRNA(mRNAおよびmicro RNA)のマイクロアレイを、平成28年度、主成分解析により若年胆管癌の発症と関連する遺伝子発現を絞り込んだ。これまでのところ代謝酵素と関わる遺伝子発現異常は特定できていないがNCBIが癌原遺伝子として公表している数種のmRNAの発現亢進を示唆する現象が確認された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由我々は前述の若年胆管細胞癌のうち当院において外科的切除された組織検体を保管しており、利用可能である。我々は、genotypingアッセイの代わりにRNAのマイクロアレイ解析を検体数を絞って行うこととした。（in vivoの方法）保管する肝組織検体において可能な解析として、（1）若年胆管細胞癌の診断マーカーとなるRNAの探索（mRNAおよびmicro RNAのマイクロアレイによる網羅的解析）、（2）(1)で得られる結果のうち化学物質の代謝酵素mRNAの定量的解析（若年胆管細胞癌の発症機序の推定）を行なうこととした。24例の肝腫瘍［胆管細胞癌10例（うち4例が印刷所症例）、対照として肝細胞癌10例および良性胆道腫瘍4例］の全検体から得たRNA抽出液を2分した。これを前述（1）のmRNA、micro RNAのマイクロアレイ用の検体とした。現在、micro RNA、mRNAのマイクロアレイの結果を基に若年胆管細胞癌における遺伝子発現異常に関する解析を行なっている。平成27年度、若年胆管細胞癌の外科的切除検体を使ったRNA(mRNAおよび、これを制御するmicro RNA)のマイクロアレイを行なった。平成28年度、主成分解析により若年胆管癌の発症と関連する遺伝子発現を絞り込んだ。結果、24個のmicro RNAと170個のmRNAが抽出された。このうち既報のない20個のmicro RNAとこれが制御するmRNAの関係をweb上のデータベースより特定した。このうち数種のmRNAについて胆管癌由来細胞株に導入し、増殖アッセイを行なった。NCBIが癌原遺伝子として公表している数種のmRNAの発現亢進を示唆する現象が確認された。
今後の研究の推進方策	平成29年度の方針として、有意な増殖アッセイの結果について検証を行なう。確かな癌遺伝子について同細胞株への導入（DNA・RNA同時あるいはmicro RNA・mRNAのsiRNA）およびさらにmicro RNAの定量的PCR解析および同定した代謝酵素の機能解析を行なう。以上から若年胆管細胞癌と関連する遺伝的リスクを探索する。 (発現異常がみられる代謝酵素と関連するRNAの検証）我々は、in vitroの方法として分化度の異なるヒト胆管癌細胞株に対して若年胆管細胞癌の発症に関連すると考えられるmicro RNAのノックインあるいはノックアウト（対象となるmRNA発現の検証）またはmRNAあるいは、これを制御するmicro RNAを用いた遺伝子導入（正常胆管細胞の誘導の検証）を行なう。これらRNAの関連する代謝酵素の機能解析（超高速液体クロマトグラフィー質量分析）を若年胆管細胞癌の肝組織検体を用いて行なう。また、発現異常がみられる代謝酵素と関連するRNA(mRNAおよび、これを制御するmicro RNA)と胆管細胞癌の関係を年齢階層別に解析し、若年胆管細胞癌を規定するRNAマーカーの抽出を目指す。若年胆管細胞癌症例の血清検体においても同様に、RNAマーカーの抽出を目指す。（臨床応用について）本計画の実験および解析により若年胆管細胞癌の遺伝的リスク（mRNAおよび、これを制御するmicro RNAの発現異常）を反映する血清マーカーとなるものが抽出できていれば当院の胆管細胞癌検診外来および肝胆膵内科（当科）外来、同外科外来において採血を行ない、胆管細胞癌発症の高リスク症例の拾い上げに用いる。高リスク症例に対しては胆管細胞癌スクリーニングを強化する。
次年度使用額が生じた理由	平成28年度は既存の胆管癌の外科的切除検体を対象に主成分解析とweb上に公開されているデータベースを用いた重要と思われる癌関連遺伝子の探索を行なった。これに一定の期間を費やした。これらは無料の統計的解析である為、この期間は研究費を使用する必要がなかった。年度の後半以降となり、ようやく研究費を使い、胆管癌由来細胞、遺伝子導入関連試薬、癌細胞増殖アッセイに用いる物品の購入をした。このため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額の使用計画	平成29年度の方針として、有意な増殖アッセイの結果について検証を行なう。確かな癌遺伝子について同細胞株への導入（DNA・RNA同時あるいはmicro RNA・mRNAのsiRNA）およびさらにmicro RNAの定量的PCR解析および同定した代謝酵素の機能解析を行なう。以上から若年胆管細胞癌と関連する遺伝的リスクを探索する。これらに遺伝子導入用試薬や細胞株を購入する。 RNAの関連する代謝酵素の機能解析（超高速液体クロマトグラフィー質量分析）を若年胆管細胞癌の肝組織検体を用いて行なう。分析用カラムを購入する。若年胆管細胞癌症例の血清検体においても同様に、RNAマーカーの抽出を目指す。血清用遺伝子抽出試薬を購入する。