| 研究課題/領域番号 |
15K08904
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
白藤 法道 福井大学, 医学部附属病院, 医員 (40529319)
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| 研究分担者 |
濱野 忠則 福井大学, 医学部, 准教授 (40334817)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 高ホモシステイン血症 / タウ蛋白 / カスパーゼ |
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| 研究実績の概要 |
ホモシステイン1～1000μMで、総タウ蛋白、リン酸化タウ蛋白の増加がTet off誘導系を導入した野生型タウ(4RON)を発現する神経細胞を用いた検討によりみられた。神経原線維変化の形成に最も重要なサルコシル不溶性画分のタウ蛋白のレベルが増加することをWestern Blot法により確認した。同様にカスパーゼによってC-末端が切断されたタウも増加していた。このことから、ホモシステイン処理によって、カスパーゼの活性化を介して、切断されたタウや、重合したタウのレベルが増加しているものと推測した。カスパーゼで切断されたタウ蛋白の増加によって神経原線維変化が生じ、タウの凝集が促進され、サルコシル不溶性画分のタウ蛋白が増加していることが疑われた。さらにタウオリゴマーを特異的に認識するTau Oligomer Complex(TOCL)抗体陽性となるタウの増加が認められた。免疫組織学的検討でも同様に100μMのHcyによりTOCL陽性細胞数の増加が認められた。また、ホモシステインが神経細胞に対してどのような効果を及ぼすかを調べるために、神経芽細胞腫細胞を培養し、顕微鏡により細胞の生存率や細胞の形態を調べた。またホモシステインを1μMから1000μM投与することにより容量依存性に神経細胞の障害がみられるかの程度も確認した。結果として、ホモシステインの容量依存性に神経細胞の数の減少や形態的な変化がみられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスニューロン初代培養細胞を用い、Hcy によるミトコンドリアを介したアポトーシス誘発機構、Caspase 活性化の検討は計画通りに進行している。Hcyによるアポトーシスの亢進については、BCL-2、活性型Caspase3、Caspase6、TauC3の各抗体を用いた。
ミトコンドリアを介するアポトーシスに関しては、抗チトクロームC抗体を用いた染色を行い解析している。
また、形態変化を位相差顕微鏡で観察するとともに、組織学的に、リアルタイムにカスパーゼ活性を表示可能なキットを用い検討した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Hcy が誘導する神経細胞死に関しては、ラット、マウス胎児海馬神経細胞培養を行い、ATP assayを用い、解析する。
さらに、免疫組織化学法にも、総タウはP44、リン酸化タウは、PHF-1・CP13を用い二重染色し、二次抗体にはAlexa 488（抗ウサギ）、594（抗マウス）を使用し、それぞれHcy 投与前後で比較検討する。なお、共焦点レーザー顕微鏡を用いて写真撮影を行う。さらに、チオフラビンSを用い、NFT 形成の有無につき組織学的検討を加える。
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