| 研究課題/領域番号 |
15K08972
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
有村 佳昭 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80305218)
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| 研究分担者 |
永石 歓和 札幌医科大学, 医学部, 講師 (30544118)
山下 健太郎 札幌医科大学, 医学部, 助教 (90381269)
仲瀬 裕志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60362498)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 骨髄間葉系幹細胞 / 炎症性腸疾患 / 幹細胞ニッチ |
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| 研究実績の概要 |
炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease，IBD）は，再燃，寛解を繰り返す慢性の難治性疾患であり，腸上皮再生をもたらす根治療法の開発が急務である．本研究は，骨髄間葉系幹細胞（cultured mesenchymal stem/stromal cells, MSC）を用いてex vivoにおいてより生理的な腸上皮幹細胞（intestinal stem cell, ISC）ニッチを人工的に再構築することを第一の目的とする．そのために，ラットISC培養技術を確立し，ニッチを構成する細胞要素としてラットMSCを利用し，非細胞要素としての細胞外基質，シグナル伝達物質，酸素飽和度などを最適化する．次に，ニッチの機能解析から新規治療標的を探索することを第二の目的とする．すなわち，ISCニッチ機能をIBDに対する再生医療へ繋ぐ新規ニッチ治療の開発が申請者の最終目標である．
したがって，本研究計画では，１．ラットISC単離・培養技術の確立，２．EnteroidとMSCの共培養によるorganoidおよびニッチ再構築，および３．ニッチ（指向性）治療標的の探索の3つの研究を並行し，分担して行う．本年度，来年度は主に上記計画１，２に重点を置き研究を遂行する．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスおよびヒト大腸上皮幹細胞の単離，培養技術は，すでにSato，Nakamura（TMDU法，Nat Med 2011）らにより報告されている．本研究では，これまで報告のないラットにおける大腸クリプトおよび大腸上皮幹細胞の単離・培養を確立した．大腸上皮幹細胞の培養に共通の必須条件は，基本培地に加え，EGF，Noggin，R-spondin，WNT3Aの4因子の存在であり，ヒトでは，さらに，Gastrin，Nicotinamideに加え，A-83-01 (ALK4,5,7阻害薬)，SB202190 (p38阻害薬) の低分子化合物を要する．しかし，これらの組み合わせでは，ラット大腸クリプトの安定したex vivo 3次元培養法は不可能であった．そこで，Ootaniらの腸管上皮初代培養法（Nat Med 2009）とTMDU法を組み合わせ，Transwellのゲル内にラット大腸組織のホモジネートを加えることで安定した培養が可能であった．さらに，大腸組織ホモジネートの上清でも長期培養が可能であった．これまでの検討から，クリプト培養に必要な活性分画は，高分子のタンパクと予想された．そこで疎水性，ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーによる粗分画・精製した．分取分画のラット大腸上皮細胞培養における生理活性の再現性を確認後，液体クロマトグラフィータンデム質量分析による同定を試みる予定である．
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究計画は，１．ラットISC単離・培養技術の確立，２．EnteroidとMSCの共培養によるorganoidおよびニッチ再構築，および３．ニッチ（指向性）治療標的の探索の3つの研究を並行し，分担して行う予定である．本年度は１．ラット大腸幹細胞培養法が確立された．来年度は主に上記計画２のニッチ再構築実験に重点を置き研究を遂行する予定である．最終年度は，３．ニッチ（指向性）治療標的の探索を網羅的に検討する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養活性分画の分取に古典的なカラムクロマトグラフィーを組み合わせて粗分画を生成したが，この作業に思いのほか時間を要し，予定のプロテオミクス解析が来年に持ち越されたため．
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| 次年度使用額の使用計画 |
粗分画の生理活性が確認されたため，液体クロマトグラフィータンデム質量分析を受託するための費用として予定通り使用される．翌年分の請求した助成金は，当初の予定通りニッチ再構築実験に捻出される．
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