| 研究課題/領域番号 |
15K08975
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
朴 雅美 近畿大学, 医学部, 講師 (70469245)
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| 研究分担者 |
萩原 智 近畿大学, 医学部, 講師 (40460852)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ガレクチンｰ3 / インドメタシン / 小腸 / 炎症 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は消化管表面に発現しているガレクチン-３の生体防御的な役割を明らかにする事を目的としている。NSAIDの１つであるインドメタシンをマウスに投与すると急性小腸炎が起こる。この炎症は腸管バリアの低下とそれに伴う細菌の侵入によるが、ガレクチン-3欠損マウスでより強く惹起される。このことから、ガレクチン-3が腸管に保護的な役割を持つことが考えられた。そこで、細胞レベルでのガレクチン-3のバリア機能への影響を明らかにするため、培養細胞株を用いた実験を実施した。膜透過性への影響を明らかにする目的でガレクチン阻害剤であるラクトース存在有無でローズベンガル色素の取り込みを検討した。その結果、コントロールと比較して取り込み能に変化は無かった。次に、siRNAを用いてガレクチン-3をノックダウンさせ、インドメタシンを添加した際の細胞数を検討した。その結果、ガレクチン-3ノックダウンのみでは細胞数に影響は見られなかったが、インドメタシン添加によって細胞数の減少が見られた。これらの結果から、細胞レベルでもガレクチン-3がインドメタシンによる傷害に対して保護的に働いている事が分かった一方で、膜透過性には関係していない可能性が示唆された。今後は類似の実験を野生型およびガレクチン-3欠損マウスから単離培養を実施した小腸細胞を用いて検討を行うと共に、マウス個体における腸管免疫の関与を調べる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究課題に関連する研究としてこれまで実施してきた「ガレクチン-３のピロリ菌感染に対する保護的役割」に関する論文執筆及びrevise実験を優先的に実施したため、当初の計画よりもやや遅れている。このピロリ菌感染の研究論文はInfection and Immunityに受理された。この論文で実施したピロリ菌感染実験では、ガレクチン-3欠損マウスが野生型に比べ感染が成立し易い事が分かった。また半年間の長期感染では野生型マウスに比べて摂餌量の低下や体重減少が認められた。さらに、ピロリ菌に対してガレクチン-3が直接結合することで抗菌作用を示すことが分かった。この作用は大腸菌では認められなかった事から菌種によって異なる影響を持つ事が分かった。ガレクチン-3が胃のみならず腸管全体の表面に発現していることは生体への細菌の侵入を防ぐバリアの１つとしてガレクチン-3が機能している可能性を示唆するものと考えている。ピロリ菌感染研究で得た知識を生かし、本研究課題である小腸炎におけるガレクチン－３の役割に関する研究を実施していき、遅延を解消していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は当初の予定に則り研究を進めていく。
野生型、Gal-3欠損マウスの小腸でマクロファージやDCの分布や数をFACS及び免疫組織学的手法によって比較する。また、それぞれのマウスから細胞を単離し、貪食能や殺菌能を比較する。さらに、各々のマウスにインドメタシンを胃内投与し小腸粘膜傷害を起こさせ、パイエル板の細胞を回収し、T細胞やB細胞それぞれの成熟マーカーの抗体でラベルし、FACS解析を実施する。B細胞は形質細胞へと分化し、免疫グロブリンA(IgA)を産生する。IgAは抗菌活性や毒素の中和活性、さらには免疫細胞活性化作用を有するなど腸管免疫において非常に重要である。そこで、腸管側に分泌されたIgAをELISAによって測定する。
野生型マウス及び、Gal-3遺伝子欠損マウスから小腸内容物を回収する。また、Gal-3欠損マウスに関してはインドメタシン投与によって形成された小腸潰瘍部に集積する細菌塊も回収し、キットを用いてDNAを回収する。シーケンス解析用アダプター配列を付加した16S rRNA領域特異的プライマーを用いてPCR増幅および精製後、次世代シーケンサーによる配列取得を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H27年度は論文の執筆とrevise研究に多くの時間を割き、当初予定していた実験計画が遅延してしまった。そのことにより、本来購入予定であった小腸細胞株2種（計約20万円）を未購入のままとなってしまった。また同様の理由でFACS解析に必要な抗体と試薬類やELISAの購入も果たせず、次年度に繰り越す運びとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
H28年度は、当初予定の研究に加えて、H27年度に実施予定であった研究を実施する。マウスの小腸でマクロファージやDCの分布や数をFACS及び免疫組織学的手法によって比較する。このために必要な抗体、試薬類を購入する予定である。また、マウスのサイトカインやIgA測定のためのELISAを購入する予定である。
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