B型慢性肝疾患におけるインターフェロン抵抗性メカニズムの解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K09002
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 柘植 雅貴 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (50448263)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: B型肝炎ウイルス / インターフェロン / 治療抵抗性

研究実績の概要

B型肝炎ウイルス（HBV）は、インターフェロン治療に対し強い耐性を示すことから、HBV genotypeによるIFN治療反応性の違いに着目し、HBVのインターフェロン抵抗性獲得のメカニズムを解明し、研究を開始した。まず、ヒト肝細胞キメラマウスの肝組織より作製されたヒト肝細胞（PXB細胞）に対し、HBV genotype Cを感染させた後、細胞を回収。非感染細胞および感染細胞からそれぞれtotal RNAを抽出後、次世代シークエンサーを用いて、遺伝子発現解析を行った。HBV感染に伴い、有意な発現変化を認めた遺伝子群を抽出した後、パスウェイ解析を施行したところ、免疫応答に関与する遺伝子群が有意に制御されていることが確認された。さらに、詳細に解析を行ったところ、Toll like receptorシグナルに関与する遺伝子（CXCL familyなど）が強く誘導されていることが分かった。また、Ingenuity pathway analysisを用いた解析では、インターフェロンシグナルに関与する遺伝子が発現更新していることが、確認された。C型肝炎領域では、肝細胞内でのインターフェロン誘導遺伝子発現が低い症例においてインターフェロン反応性が良いといった報告もあることから、HBV感染に伴うインターフェロン誘導遺伝子の発現亢進は、HBVのインターフェロン抵抗性獲得メカニズムの一部に関与している可能性も考えられる。今後は、HBV genotype A感染細胞での遺伝子発現変化も解析し、より強くインターフェロン抵抗性獲得に寄与する遺伝子を同定するとともに、HBVによる標的遺伝子の制御メカニズムの同定と標的遺伝子発現制御によるインターフェロン反応性の変化について解析していく予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HBV感染PXB細胞の遺伝子発現解析を次世代シークエンサーを用いて解析することにより、これまでin vivoで行ってきた解析結果とほぼ同等の結果が得られている。in vivoではHBV genotype A感染時にウイルス量の増加が遅いなどの問題があったことから、PXB細胞を用いることでその影響が回避できる可能性が高いものと推測できる。さらに、遺伝子発現解析におけるデータも、PXB細胞でも十分得られることが確認できたことから、研究はおおむね順調に進んでいるものと判断した。

今後の研究の推進方策

HBV genotype A感染PXB細胞を用いた遺伝子発現解析結果と比較し、HBV genotypeによるヒト肝細胞の反応性の差異を明らかにし、その反応性の相違からインターフェロンや核酸アナログに対する感受性に寄与する遺伝子の同定を試みる。さらに、次年度は、当初の計画の通り、抽出されたIFN抵抗性関連遺伝子とHBV関連蛋白との相互作用について検討していく予定である。HBV感染による遺伝子発現制御は、転写レベルもしくはmRNA安定性による制御が考えられることから、遺伝子発現制御メカニズムを詳細に解析するため、抽出されたIFN感受性関連遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイのほか、HBV存在下・非存在下におけるmRNA、蛋白の発現変化についてもリアルタイムPCR、ウエスタンブロットにて解析し、遺伝子発現制御がどのレベルで生じているか詳細に解析する。さらに、次年度から次々年度にかけて、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた研究を行い、HBV genotype Aおよびgenotype C感染マウスに対し、ヒトPBMCを投与し劇症肝炎モデルの作製を試みる。その際、臨床的にはHBV genotype A感染においてALTが低めであり、肝炎が遷延することが多いことから、ヒトPBMCを接種することで生じる肝細胞内での炎症（肝炎）の程度を評価し、臨床病態との相関を評価する予定である。また、次世代シークエンサ解析にて抽出された標的遺伝子の発現を制御することで、肝組織の炎症が変化するか否かについても解析する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Effect of tenofovir disoproxil fumarate on drug-resistant HBV clones. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murakami E., Tsuge M., Hiraga N., Kan H., Uchida T., Masaki K., Nakahara T., Ono A., Miki D., Kawaoka T., Abe H., Imamura M., Aikata H., Ochi H., Hayes C.N., Akita T., Tanaka J. and Chayama K.
  • 雑誌名: Journal of Infection 巻: 72 ページ: 91-102
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2015.09.038
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improvement of renal dysfunction in a patient with HCV-related liver cirrhosis by daclatasvir and asunaprevir combination therapy: A case report. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsuge M, Hiramatsu A, Shinohara F, Nakano N, Nakamura Y, Hatooka M, Morio K, Morio R, Kan H, Fujino H, Uchida T, Kobayashi T, Fukuhara T, Masaki K, Nakahara T, Ono A, Nagaoki Y, Miki D, Kawaoka T, Hiraga N, Imamura M, Kawakami Y, Aikata H, Ochi H, Hayes CN, Chayama K.
  • 雑誌名: Hepatology Research 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12629.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antiviral effects of anti-HBs immunoglobulin and vaccine on HBs antigen seroclearance for chronic hepatitis B infection. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsuge M, Hiraga N, Uchida T, Kan H, Miyaki E, Masaki K, Ono A, Nakahara T, Abe-Chayama H, Zhang Y, Naswa MG, Kawaoka T, Miki D, Imamura M, Kawakami Y, Aikata H, Ochi H, Hayes CN, Chayama K.
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] On-treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue therapy. (2015)
  • 著者名/発表者名: Huang Y.W., Takahashi S., Tsuge M., Chen C.L., Wang T.C., Abe H., Hu J.T., Chen D.S., Yang S.S., Chayama K. and Kao J.H.
  • 雑誌名: Antiviral therapy 巻: 20 ページ: 369-375
  • DOI: 10.3851/IMP2777
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Factors associated with the effect of interferon-alpha sequential therapy in order to discontinue nucleoside/nucleotide analog treatment in patients with chronic hepatitis B. (2015)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto A., Yatsuhashi H., Nagaoka S., Suzuki Y., Hosaka T., Tsuge M., Chayama K., Kanda T., Yokosuka O., Nishiguchi S., Saito M., Miyase S., Kang J.H., Shinkai N., Tanaka Y., Umemura T. and Tanaka E.
  • 雑誌名: Hepatology Research 巻: 45 ページ: 1195-1202
  • DOI: 10.1111/hepr.12488.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Differences in serum microRNA profiles in hepatitis B and C virus infection. (2015)
  • 著者名/発表者名: Akamatsu S., Hayes C.N., Tsuge M., Miki D., Akiyama R., Abe H., Ochi H., Hiraga N., Imamura M., Takahashi S., Aikata H., Kawaoka T., Kawakami Y., Ohishi W. and Chayama K.
  • 雑誌名: Journal of Infection 巻: 70 ページ: 273-87
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2014.10.017.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human Cytotoxic T Lymphocyte-Mediated Acute Liver Failure and Rescue by Immunoglobulin in Human Hepatocyte Transplant TK-NOG Mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Uchida T., Hiraga N., Imamura M., Tsuge M., Abe H., Hayes C.N., Aikata H., Ishida Y., Tateno C., Yoshizato K., Ohdan H., Murakami K. and Chayama K.
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 89 ページ: 10087-96
  • DOI: 10.1128/JVI.01126-15.
  • 査読あり
• [学会発表] HBV RNA量を用いた核酸アナログ中止後再燃予測 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴、川上広育、茶山一彰
  • 学会等名: 第42回日本肝臓学会西部会（パネルディスカッション）
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2015-11-25 – 2015-11-25
• [学会発表] Difference of intracellular responses by HBV genotype A and C infection in humanized mouse model (2015)
  • 著者名/発表者名: Masataka Tsuge, Nobuhiko Hiraga, Hiromi Abe, Daiki Miki, Michio Imamura, Hidenori Ochi, C Nelson Hayes, Kazuaki Chayama
  • 学会等名: AASLD2016（ポスター）
  • 発表場所: 米国（サンフランシスコ）
  • 年月日: 2015-11-16 – 2015-11-16
  • 国際学会
• [学会発表] B型肝炎治療の現状 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴
  • 学会等名: JDDW 2015（ランチョンセミナー）
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-10-09 – 2015-10-09
  • 招待講演
• [学会発表] HBV genotype C感染例におけるHBs抗原消失に関する検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴、村上英介、茶山一彰
  • 学会等名: JDDW 2015（ワークショップ）
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-10-08 – 2015-10-08
• [学会発表] HBV genotypeと核酸アナログの抗ウイルス効果 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植 雅貴、村上英介、平賀 伸彦、阿部弘美、今村 道雄、秋田智之 、田中純子 、茶山 一彰
  • 学会等名: 第11回広島肝臓プロジェクト研究センターシンポジウム（一般演題）
  • 発表場所: 広島
  • 年月日: 2015-07-04 – 2015-07-04
• [学会発表] HBV感染に伴うmicroRNA発現変化と miRNAによるHBV複製制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴、平賀伸彦、村上英介、阿部弘美、三木大樹、河岡友和、平松 憲、今村道雄、川上由育、相方 浩、越智秀典、茶山一彰
  • 学会等名: 第51回日本肝臓学会総会（一般演題）
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 2015-05-22 – 2015-05-22
• [学会発表] 核酸アナログ中止例における HBVコア蛋白のアミノ酸変異に関する解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村上英介、柘植雅貴、内田宅郎、菅 宏美、柾木慶一、本田洋士、中原隆志、大野敦司、平賀伸彦、河岡友和、平松 憲、今村道雄、相方 浩、茶山一彰、川上広育
  • 学会等名: 第51回日本肝臓学会総会（一般演題）
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 2015-05-22 – 2015-05-22
• [学会発表] 当院におけるHBVキャリアのHBs抗原陰性化と肝発癌に関する検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村上英介、柘植雅貴、茶山一彰
  • 学会等名: 第101回日本消化病学会総会（シンポジウム）
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2015-04-16 – 2015-04-16
• [学会発表] 核酸アナログ先行投与によるインターフェロン反応性の変化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 柘植雅貴、平賀伸彦、茶山一彰
  • 学会等名: 第101回日本消化病学会総会（ワークショップ）
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2015-04-14 – 2015-04-14
• [産業財産権] 高力価のB型肝炎ウイルスを産生する細胞およびその作製方法 (2015)
  • 発明者名: 柘植雅貴、茶山一彰
  • 権利者名: 柘植雅貴、茶山一彰
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: JP2015/081135
  • 出願年月日: 2015-04-10