研究課題
難治性重症心不全の発症分子機序を解明し、心不全エピゲノム臨床診断法の確立を目指すため、重症心不全組織検体、独創的な超微細構造解析技術を利用し、分子生物学と病理学を臨床診療に応用する研究を行う研究である。独自に開発したクロマチンスコアを疾患の分子機序解明に活用し、慢性増悪進行型の難治性心不全の分子病態を明らかにすることを目的として「非可逆不全心筋」と「可逆性心筋」の分別指標の確立、新指標に基づく心不全モデル動物の重症度評価、難治性心不全の分子探索および病態の解明、の３つの戦略に分けて本研究に取り組んだ。細胞核クロマチン構造変化の定量化法「クロマチンスコア」計測法を確立するために以下の検討を行った。マウスの知見をヒトへ応用し、重症心不全組織の心筋細胞核クロマチン構造変化を解析するため、①ヘテロクロマチンの領域サイズが心不全病態変化に強く相関すること、②クロマチン構造の変化は遺伝子発現や組織性状変化よりも上流でとらえられること、③ヘテロクロマチンの領域サイズを表す定量計測法「クロマチンスコア」測定法を確立したことを報告した。電子顕微鏡クロマチン構造計測による本方法は、従来にない高い感度特異度を示すこと、心不全指標である心エコー計測値、心臓線維化等とは相関を示さない新しい計測値であることがわかった。心不全を感知する遺伝子発現エンハンサー領域CR9の同定とエンハンサー活性測定系の確立によるマウス心不全重症度生体評価法の確立するため以下の検討を行った。心不全関連生体分子の探索や心不全病態解析による創薬開発への利用を考える上で、循環機能計測における低侵襲、簡便、個体維持を前提とした生体ライブイメージング技術の開発が必須であった。上記を克服すべく、申請者らは、世界に先駆けて心不全によりANP, BNPが誘導されるエンハンサー領域CR9を同定し、細胞解析系、生体モデル動物を作成した。
1: 当初の計画以上に進展している
当初より以下3項目を全体計画に据えている。（A）非可逆不全心筋と可逆性心筋の分別指標確立、（B）新指標に基づく心不全感受性生体イメージングマウスの重症度解析、（C）心不全難治化を規定する分子探索・機能解析による難治化病態の解明。上記よりH27年度は以下の通り予想以上の進捗を得た。（A）クロマチンスコア自動計測装置を完成させてのち、それを用いて5年来の期間に蓄積した中等症心不全～最重症心不全症例を対象にした心筋生検病理サンプル解析を実施した。（Kanzaki et al. PLoS One 2016）ヒト重症心不全組織のクロマチンスコアのパイロット解析により難治化症例に特徴的な数値の変化を認め検討を進めている。（B）クロマチン構造変化を見る際に用いるマウスは、重症度が均一な組織検体の収集を実現させるため、BNP発現の生体定量可視化に成功した心不全生体モニタリングマウスを作製した。同マウスは、新規に同定した心不全特異的BNP発現エンハンサー（CR9）を利用し独自に開発した心不全感受性生体イメージングマウス（CR9マウス）である。同じCR9レポーターベクターを用いた心筋細胞レポーター遺伝子アッセイ系も同時構築した。さらにCR9のノックアウトマウスも作成し心不全病態解明の動物モデルを現在作成中である。（C）心不全心筋組織検体を用いて、心不全難治化にかかわる分子を探索するため、該当する組織を収集し保存する。一定量の検体を揃えRNA-seq解析および分画化処理を行い、蛋白発現解析をおこなった。
これまでの研究において、重症心不全の臨床病態の鑑別が可能な、独自のクロマチン構造解析技術を開発した。H28年に引き続きH29年度にも予定以上の進捗を得たので、H29年度はさらに予定を前倒して検討を進める。(A) (B) 非可逆・可逆不全心筋の分別指標に基づく心不全モデル動物の重症度評価重症化した心不全のみならず、中等症に至るまで様々な心不全症例のクロマチンスコアを検索する。さらに心不全難治化の臨床病期（point of no return）のみならず、①各治療による心不全改善とともにクロマチン構造が変化し得るか、②その際難治化指標をまたぐ変化を来たし得るか、について検討を行う。前年度と同じ心不全感受性生体イメージングマウス（CR9マウス）を用い、重症度変化をトレースできるようにする。(C) 心不全難治化を規定する分子探索・機能解析による難治化病態の解明難治化を規定するマーカーを持つ心筋と、もたない心筋に分別を行いRNA-seq解析および分画化処理を行い、蛋白発現解析を実施し候補分子をリスト化する。発現上昇、低下する各分子に対して、実際の組織発現の変化が認められるか確認を行うとともに、CR9心筋細胞を用いてそれら遺伝子の発現増強、抑制による心筋細胞機能の変化を解析する。難治化に生じた心筋細胞変化と類似の現象を捉えた場合、CR9心筋細胞における機能解析を実施し、心筋難治化を再現することで難治化の分子生物学的意義を解析する。
心臓移植検体からのレシピエント心・臨床検体を数量多く解析する予定であったが、心臓移植の実施症例が当初の予想とずれてしまい、解析の時期タイミングが合わず、年度末に検体採取がずれこんでしまったため、翌年度の解析において実施することとなった。
28年度の解析において使用する予定である。
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PLoS One.
巻: 11 ページ: e0148209
10.1371/journal.pone.0148209.
