| 研究課題/領域番号 |
15K09159
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
平野 真弓 九州大学, 医学研究院, 助教 (80336031)
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| 研究分担者 |
平野 勝也 香川大学, 医学部, 教授 (80291516)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | プロテイナーゼ活性化型受容体１ / 血管内皮細胞 / 血管平滑筋細胞 / 血管バリアー機能障害 / ミオシン軽鎖リン酸化 / トロンビン / 脱感作障害 / 凝固因子XI |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、プロテイナーゼ活性化型受容体1(PAR1)の観点から血管病の発症・進展に関わる分子機構を明らかにし、新たな治療法を開発することを目的とする。
1.PAR1による内皮機能障害の分子機構を明らかにする。
トロンビン刺激によりPAR1が活性化されると血管内皮細胞のバリアー機能障害が引き起こされる。これまでの多くの報告では、血管内皮細胞のバリアー機能障害にアクチンストレスファイバー形成が重要とされてきた。本研究では①トロンビンによるバリアー機能障害の初期相には細胞辺縁部におけるミオシン軽鎖リン酸化とアクチン線維束形成が、持続相にはアクチンストレスファイバー形成が重要で、収縮分子が時間的、空間的に異なる制御を受けていることを明らかにした。②トロンビンによるバリアー機能障害の初期事象として重要な、辺縁部でのアクチン線維束形成とミオシン軽鎖2リン酸化、およびバリアー機能障害にRhoA-Rho キナーゼ経路が関与することを明らかにした。③収縮分子が受ける時間的、空間的に異なる制御には、細胞間接着の強度が関わることを明らかにした。
2.平滑筋細胞機能障害の分子機構を明らかにする。
①PAR1ノックアウトマウスは、低酸素誘発肺高血圧症の病態形成を抑制した。②ラット大動脈平滑筋細胞において凝固因子XIが新たなPAR1の活性化因子であることを明らかにした。また、凝固因子XIの細胞に対する作用についての報告は無く、直接作用を始めて明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１.PAR1による内皮機能障害の分子機構を明らかにする。
トロンビン刺激によりPAR1が活性化されると血管内皮細胞のバリアー機能障害が引き起こされる。血管内皮細胞のバリアー機能障害にアクチンストレスファイバー形成が重要とされていた。本研究ではトロンビンによるバリアー機能障害の初期相には細胞辺縁部におけるミオシン軽鎖リン酸化とアクチン線維束形成が、持続相にはアクチンストレスファイバー形成が重要で、収縮分子が時間的、空間的に異なる制御を受けていることを明らかにした。Rhoキナーゼ阻害剤により辺縁部でのアクチン線維束形成およびミオシン軽鎖2リン酸化は抑制され、バリアー機能障害も抑制された。さらにシンバスタチンを用いてRhoA活性を抑制すると、トロンビンによるミオシン軽鎖2リン酸化とアクチン繊維束形成が抑制され、バリアー機能障害も回復した。このことから、トロンビンによるバリアー機能障害の初期事象として重要な、細胞辺縁部でのミオシン軽鎖２リン酸化とアクチン線維束形成には、RhoA-Rho キナーゼ経路が関与することを明らかにした。
2.平滑筋細胞機能障害の分子機構を明らかにする。
①PAR1ノックアウトマウスは、低酸素誘発肺高血圧症の病態形成（右室収縮血圧上昇、右室肥大、肺血管筋性化）を抑制したことから、肺高血圧症の発症においてPAR1が重要な役割を果たすことを明らかにした。②凝固因子XIをラット大動脈平滑筋細胞に作用させると、カルシウム流入を引き起こした。このカルシウム流入はPAR1阻害剤により抑制されたことから、凝固因子XIが新たなPAR1活性化因子であることを明らかにした。また、細胞に対する凝固因子XI の作用はこれまで報告は無く、凝固因子XIの細胞に対する直接作用を始めて明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.内皮細胞収縮によるバリアー機能障害の分子機構を明らかにする。
トロンビンによる内皮細胞のバリアー機能障害に関わるRhoA-Rhoキナーゼからミオシン軽鎖リン酸化に至るまでの分子機構をRNA干渉法、変異体の導入、免疫沈降法、Two-hybrid法を用いて明らかにする。さらに内皮細胞のアクチン繊維束形成やミオシン軽鎖2リン酸化は、細胞間接着が強い場合に細胞辺縁部に局在することから、初期事象としてのバリアー機能制御に関わる接着分子を明らかにする。
2．PAR1による平滑筋機能障害の分子機構を明らかにする。
①凝固因子XIによるPAR1を介したカルシウム流入の分子機構を薬理学的阻害剤、RNA干渉法、変異体の導入などを用いて明らかにする。②A7r5細胞は、トロンビンによりPAR1の脱感作障害を引き起こし、カルシウム濃度上昇が持続する。A7r5を用いてカルシウム動態、受容体のリン酸化、βアレスチンとの結合、受容体のリン酸化などを検証し、脱感作障害に関わる分子や機構を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H27年度、H28年度ともに国際学会へ参加しなかった為、繰越金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
培養細胞実験に使用する血清・培養試薬・培養器具類に40万円。病態モデル実験に使用する動物・飼育費等に40万円、一般実験および遺伝子導入実験に使用する試薬類に45万円、学会での成果発表に10万円を使用する。
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