2015 年度実施状況報告書

Nsd1の転写機構解明と次世代型動脈硬化治療薬の開発

研究課題

研究課題/領域番号	15K09161
研究機関	琉球大学
研究代表者	早川朋子琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30420821)
研究分担者	松下正之琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30273965)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	血管生物学 / 血管平滑筋細胞 / 細胞分化 / ヒストン修飾
研究実績の概要	動脈硬化症の大きな原因は、血管平滑筋細胞(Smooth muscle cell: SMC)脱分化とそれに伴う増殖と遊走であることが知られている。閉塞血管に対して薬剤徐放性ステント移植が広く行われているが、10%もの高率でSMC増殖による再狭窄が起こることから、SMC脱分化を強力に抑制する新薬の開発が喫緊の課題である。このような背景のもと、申請者らは「動脈硬化様の合成型SMCに対してヒストン修飾酵素Nsd1を抑制することにより、正常血管に近い収縮型SMCへ移行できる」との発見をした。これは、Nsd1阻害剤が有効な動脈硬化治療薬になる可能性を示唆している。しかしNsd1の働きや転写機構がほぼ不明であることから、本研究ではNsd1によるSMC分化・脱分化機構を明らかにし、Nsd1を標的とした次世代型動脈硬化治療薬の開発に取り組むこととした。本年度の主な研究実績は、CRISPR/Cas9システムを用いてNsd1遺伝子欠損マウスを作製である。gRNA-Cas9発現ベクターを前核期受精卵にインジェクションし、受容雌マウス8匹に移植した。受容雌マウスから生まれたF0産子は合計25匹を確認することができた。成育した個体17匹の組織よりDNAを調整し、ダイレクトシークエンスを行った。Cas9標的領域の配列を解析した結果、9匹は変異が認められなかったが8匹には塩基配列の欠損または挿入といった変異が認められ、Nsd1遺伝子改変マウスの作製を確認した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由遺伝子改変マウスの作製に予想外の時間がかかったため、Nsd1と結合する転写因子の同定を行うことが出来なかった。具体的には、F0産子がなかなか生まれてこず複数回のインジェクションを行った事、さらに、ヘテロ欠損のF1産子のほとんどが雌だったためにF2マウスの増殖に時間がかかった事、さらにはヘテロ欠損マウスの交配によるホモ欠損マウスが生まれてこないことを確認するために複数回の交配を行った事が原因である。
今後の研究の推進方策	上記の進捗状況より検討した研究の推進方策を箇条書きにし、具体的な実験計画を以下に示す。１）Nsd1ヘテロ欠損マウスによる頸動脈結紮モデルの解析＿野生型、Nsd1ヘテロ欠損マウスの頸動脈結紮モデルの解析を行い、野生型マウスの結紮部位に観察される内膜肥厚が、ヘテロ欠損マウスで低下するかを調べる。２）Nsd1高発現・SETドメイン欠損Nsd1高発現マウスの作製＿ヒトNsd1 cDNAを用いて、Nsd1高発現、SETドメイン欠損Nsd1高発現トランスジェニックマウスを作製する。その後、頸動脈結紮モデルを作製し、内膜肥厚を解析する。３）Nsd1と結合する転写因子の同定＿Nsd1とHA抗体によって免疫沈降、TOF MS/MS解析を行い、SMCにおいてNsd1と結合するタンパク質を網羅的に探索する。さらにChIP sequenceの結果と比較して転写因子を同定する。同定した転写因子のChIP sequenceを行い、Nsd1と同時に結合するDNA領域を調べる。Nsd1、HA抗体を用いて、ChIP sequence解析を行う。Nsd1結合DNA配列に対しgenomatrix社製GGAクラウド型解析サーバーを用いて転写因子が結合する特異的配列を探索し、27年度のMS解析データと比較しNsd1と結合する転写因子Xを推測する。転写因子XとNsd1の抗体を用いて免疫沈降・ウエスタンブロットを行い、これらの結合を確認し、転写因子の抗体を用いてChIP-PCRを行う。転写因子XとNsd1が同じ領域に結合するか検討する。転写因子XをsiRNAによって抑制して(Fig2Cと同じ実験)、Nsd1抑制と同様に脱分化SMCへ移行するか確認する。４）SETドメインの機能アミノ酸の同定とNsd1阻害剤の作製＿SETドメインに点変異を網羅的に導入して、機能アミノ酸を探索する。その後、Nsd1阻害剤の探索を行い、動物モデルにより阻害剤の有効性を検証する。
次年度使用額が生じた理由	遺伝子改変マウスの作製に予想外の時間がかかったため、Nsd1と結合する転写因子の同定を行うことが出来なかった。具体的には、F0産子がなかなか生まれてこず複数回のインジェクションを行った事、さらに、ヘテロ欠損のF1産子のほとんどが雌だったためにF2マウスの増殖に時間がかかった事、さらにはヘテロ欠損マウスの交配によるホモ欠損マウスが生まれてこないことを確認するために複数回の交配を行った事が原因である。以上の理由によりNsd1と結合する転写因子同定が行えず、抗体の購入が次年度になったため次年度使用額が生じた。次年度使用額は78000円である。
次年度使用額の使用計画	Nsd1、HA抗体を購入する。これらの抗体を用いてNsd1とHA抗体によって免疫沈降、TOF MS/MS解析を行い、SMCにおいてNsd1と結合するタンパク質の網羅的探索を行う。さらにChIP sequenceの結果と比較して転写因子を同定する。同定した転写因子のChIP sequenceを行い、Nsd1と同時に結合するDNA領域を調べる。Nsd1、HA抗体を用いて、ChIP sequence解析を行う。Nsd1結合DNA配列に対しgenomatrix社製GGAクラウド型解析サーバーを用いて転写因子が結合する特異的配列を探索し、27年度のMS解析データと比較しNsd1と結合する転写因子Xを推測する。