| 研究課題/領域番号 |
15K09202
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構東京病院(臨床研究部) |
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研究代表者 |
田下 浩之 独立行政法人国立病院機構東京病院(臨床研究部), 臨床研究部, アレルギー科医長 (00407933)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 肥満 / 喘息 / レプチン / アディポカイン / 線維芽細胞 / Ob-R |
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| 研究実績の概要 |
背景：肥満は喘息のリスクファクターであり、さらに肥満喘息患者は喘息コントロールが悪く、喘息治療に対する反応性も悪いことが知られている。この原因として、肥満により物理的に呼吸機能が低下すること以外にも、肥満に伴い増加した脂肪細胞から産生されるレプチン等アディポカインの作用により、気道炎症が増悪することが明らかになりつつある。しかしながら、レプチンによる肺線維芽細胞に対する影響はほとんど明らかにされていない。
目的：レプチンが肺線維芽細胞に及ぼす影響およびその機序を明らかにすることを目的とする。
方法：正常ヒト肺線維芽細胞（NHLF）に、レプチンおよび炎症性サイトカインを作用させ、これらの細胞のサイトカイン産生を、realtime PCRおよびCBA（Cytometric Bead Array）アッセイにより解析した。また、同様にレプチンを作用させ、NHLFの増殖能を細胞増殖ELISA、BrdU発色キットで解析した。最後に、NHLFによるレプチンレセプター、ObRの発現を、realtime PCRおよびflowcytometryにより解析した。
結果：レプチンは、濃度依存的にNHLFのMCP-1、EotaxinのmRNA発現を増強し、レプチン10 μM、4時間刺激で最大の効果を示した。同様に、レプチンは濃度依存的にMCP-1、Eotaxinのタンパク発現を増強し、レプチン10 μM、48時間刺激で最大の効果を示した。また、レプチンは濃度依存的にNHLFの細胞増殖を促進し、レプチン10 μMで最大の効果を示した。最後に、レプチンは遺伝子レベル、タンパクレベルで既知のレプチンレセプター、Ob-Rを発現していた。
考察：肥満が喘息を増悪させる機序の一つに、レプチンのOb-Rを介した肺線維芽細胞からのサイトカイン、ケモカイン産生能の増強および増殖能の亢進が関与している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、レプチンはNHLFのサイトカイン産生を、mRNA、タンパクレベルで増強し、増殖能も亢進することを見出した。また、レプチンの作用点の候補として、NHLFが既知のレプチンレセプター、Ob-Rを発現することも確認した。
成果として記載する段階ではないが、今年度は線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換を示唆するαSMAの発現をウエスタンブロットで評価するシステムの確立、および主要な細胞外マトリックスであるコラーゲンをウエスタンブロットで評価するシステムの構築、NHLFが活性化することにより引き起こされる収縮能を定量化するgel contraction assayシステムの構築を完成しており、大凡計画通りの達成度であると考えている。
次年度、即ち最終年度は、前述のNHLFのαSMA、 コラーゲンの発現に対するレプチンの作用を明らかにすることと、Ob-Rの阻害、ノックダウンを行うことで、レプチンのNHLFに対する作用の変化を解析する予定である。レプチンの濃度や作用時間等の条件設定が済んでいるため、比較的速やかに実験を遂行できるものと考えている。
また、今年度は倫理審査委員会の承認を得て当院に保管している臨床検体由来の線維芽細胞の中から、間質性肺疾患由来の検体を選別した。次年度はそれらを用いて速やかに臨床検体の解析を行うことが可能と考えられ、大凡計画に沿ったスピードである。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度はまず、線維芽細胞の重要な機能である細胞外マトリックス産生、およびゲル収縮能に対するレプチンの作用を明らかにする。前述の通り、既にシステムは確立したため、速やかに実験が遂行できる。
また、レプチンによるNHLF活性化作用発現の、責任レセプターを明らかにするが、NHLFによる既知のレプチンレセプター、Ob-R発現は確認したため、その中和抗体やSiRNAを用いて、レセプターを阻害し、レプチンによる線維芽細胞活性化に対する影響を確認する予定である。
さらに、細胞内シグナル伝達物質のインヒビターを用いて、その責任分子を明らかにし、レプチン刺激による細胞内分子のリン酸化の有無をウエスタンブロット等で確認する予定である。
また、実際の手術肺から分離培養したNHLFおよびその患者由来の肺標本の中から、間質性肺疾患および健常肺由来のものを選別したため、免疫染色によりレプチンやレプチンレセプターの発現レベルの差異を、また疾患の有無によりNHLFに対するレプチンの影響の差異を検討する予定である。
以上のデータが揃えば、速やかに学会や学術誌に報告を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年3月中に納品を予定していた試薬の納期が4月に遅れたために残額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記理由により残額が生じたが、平成29年度交付額と合わせた額の執行を予定している。
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