| 研究課題/領域番号 |
15K09208
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
黒谷 玲子 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (00453043)
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| 研究分担者 |
阿部 宏之 山形大学, 大学院理工学研究科, 教授 (10375199)
今野 博行 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (50325247)
柴田 陽光 山形大学, 医学部, 講師 (60333978)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | COPD / SCGB3A2 / STAT1 / STAT3 / A1AT |
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| 研究実績の概要 |
慢性閉塞性肺疾患（COPD）は主に喫煙によって気道と肺胞に慢性炎症が生じることで発症し、末梢気道壁の肥厚・狭窄、肺胞壁の破壊、肺胞マクロファージ数の増加などの特徴を示す。COPDは禁煙で進展抑制可能だが、進展したCOPDを根治させる治療は存在せず、気管支拡張剤吸入やリハビリテーションなどの理学療法による対処となり、QOLの改善は難しい。日本での死亡原因の第9位となっており、COPDに対する根治療法の開発が望まれる。一方、本研究で注目するSecretoglobin (SCGB) 3A2は、肺炎や肺線維症の改善効果、肺発生における細胞増殖や線毛の再生効果を有する。そこで、本研究ではCOPDに対するSCGB3A2の効果の検討を目的とした。主にScgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルの解析によってSCGB3A2のCOPDに対する効果を検証した。Scgb3a2の野生型(WT)マウス、欠損(KO)マウス、肺特異的過剰発現(TG)マウスの生理機能を調べた結果、タバコ煙非曝露条件下でのKOマウスの肺コンプライアンスは有意に増加した。さらに、タバコ煙曝露後の組織学的解析によってKOマウス肺での肺胞腔の拡大は顕著であり、KOマウスの平均肺胞壁間距離(Lm)と肺胞破壊指数(DI)の有意な増加も認めた。一方、TGマウス肺ではタバコ煙曝露後のLm値もDI値も非曝露条件と比較して統計学的有意差は認められなかった。以上の結果から、SCGB3A2のCOPD（肺気腫）に対する抑制的（改善）効果を示した。このことは、進行したCOPDの治療薬が存在しない現在において、SCGB3A2のCOPD治療への貢献を示す重要な結果であり、医学分野において非常に意義の高い成果である。本年度はそのメカニズムの解明として、SCGB3A2はα1アンチトリプシン(A1AT)発現を制御することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究ではCOPDに対するSCGB3A2の効果の検討を目的とし、Scgb3a2遺伝子改変マウスを用いたタバコ煙曝露COPDマウスモデルを作製し、SCGB3A2のCOPDに対する効果を検証しSCGB3A2のCOPD（肺気腫）に対する改善効果を示唆する結果を示してきた。本年度は、改善効果の直接的なメカニズムに着目し、SCGB3A2のα1アンチトリプシン(A1AT)の発現制御への関与を検討した。まず、MLg細胞をSCGB3A2で刺激した際のA1AT，STAT1, STAT3の発現をウェスタンブロットで確認し、SCGB3A2によって全タンパク質の発現増加を確認した。STAT3は肝臓等でA1AT遺伝子発現を上方制御すること、STAT1はSCGB3A2の下流シグナルであり、STAT3と同じJAKを介することが報告されている。また、STAT1とSTAT3はヘテロダイマーを形成することが報告されている。続いて、SCGB3A2の刺激時間によるA1AT発現とSTAT1,STAT3のリン酸化を調べた。この結果、刺激1時間後には全てのタンパク質の発現が増加した。このことから、これらの分子はSCGB3A2により直接制御されている可能性が高いことが明らかになった。そこで、STAT1とSTAT3のsiRNAを用いてそれぞれをノックダウンした時のそれぞれのタンパク質発現とA1AT発現を確認した。この結果を裏付けるための過剰発現系を現在構築しているところであり、まだ不完全ではあるが、多くの興味深い結果が得られてきたため、計画以上の進展であったと判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
SCGB3A2による肺気腫抑制（改善）効果のメカニズムとして、SCGB3A2によるA1ATの発現制御に注目している。そこで、１）STAT1とSTAT3のsiRNAを用いてそれぞれをノックダウンした時のSTAT1,STAT3およびA1AT発現を再度確認する。また、STAT1とSTAT3を同時にノックダウンした時のA1AT発現も確認する。２）現在作成中のSTAT1とSTAT3のexpression vectorを用いて、STAT1とSTAT3をそれぞれ、もしくは同時に高発現した時のA1AT発現を検討する。さらに３）A1ATへのSTAT1とSTAT3の結合をChIPアッセイで確認するとともに、STAT1とSTAT3のダイマーの状態を免疫沈降法により明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大学での業務（講義準備、会議）へのエフォートが予定より高くなったために、実験を行える時間が計画時より少なくなった。いくつかの実験を指導学生と共に行っているが、学生の就職活動等により当初の計画より進行できない部分が生じてきたため、予定していた一部の実験に必要な試薬等を購入しなかったため。しかしながら、研究成果自体は予定より進むことができたため、時間のかかる実験についてキットなどの利用を検討し、効率的に成果を出せるように調整中である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
大学業務のうち、会議の調整は個人だけでは難しいが、講義準備は早めに行っており、実験を行う時間を確保できるようになった。キットなどをうまく利用し、少ない研究時間を有効に使用することに計画を変更した。特にSCGB3A2のA1AT遺伝子発現調節に関しては、ChIPアッセイが重要な解析となるため、通常すべての試薬を自分で調整していたが、本研究ではキットを利用して解析を行う計画としている。
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