| 研究課題/領域番号 |
15K09234
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
長内 和弘 金沢医科大学, 医学部, 教授 (70221158)
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| 研究分担者 |
小林 誠 金沢医科大学, 医学部, 助教 (20460355) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 急性肺傷害 / リポポリサッカライド / リゾリン脂質 / リゾリン脂質アシル基転移酵素 / 肺胞Ⅱ型上皮細胞 / アデノ随伴ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は治療法の乏しい、いまだに死亡率の高い疾患である。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスホリパーゼＡ2の作用によりリゾホスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。これらリゾリン脂質は炎症をさらに増悪させると推測されるが、ARDSの病態生理における意義はかならずしも明らかにされてこなかった。リゾリン脂質アシル基転移酵素はリゾリン脂質に対しアシル基を転移し、元の安定なリン脂質に戻す作用がある。本研究は生体への抗原性の乏しいアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ARDS実験モデル肺に同酵素を遺伝子導入することで、ARDSにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、有効な薬物治療の乏しいARDSに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。
今年度はリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素(LPCAT)およびコントロールとしてLacZ酵素を組み込んだAAVウイルスの作成を行った。AAVウイルスにはいくつかの血清型が存在するが、文献(Strobel B et al. Am J Respir Cell Mol Biology 53:291-302, 2015 )によると気道-肺胞系にもっとも遺伝子発現効率の高いものはAAV6.2とされている。しかしAAV6.2は市販されていないため、われわれはAAV6を鋳型にしてMutagenesisを誘導し、AAV6.2を作成し、DNAシークエンスにて正しく作成されていることを確認した。またIn vivo動物実験においてマウスやラットへ気管内投与し、肺組織において十分な遺伝子発現を得るためには大量のAAVウイルス作成が必要であり、この方法のプロトコールを作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２８年度までにＬａｃＺおよびＬＰＣＡＴ-ｃＤＮＡを組み込んだリコンビナントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の作成を終了した。さらに市販されていない気道‐肺胞組織に高い遺伝子発現を示すとされているAAV6.2リコンビナントウイルスをわれわれ自身で作成した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に必要なラット肺胞Ⅱ型上皮細胞を単離し、インサートウェル内での気相培養法を行い、肺胞Ⅱ型上皮細胞の分化機能を維持した培養法を確立した。さらにＩｎ ｖｉｔｒｏ動物実験に必要な大量のウイルスを作成するためのプロトコールの開発にも成功した。
以上のように平成２８年度まで予定していた実験の大半をおおむね順調に終了した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度は今年度までに用意したＡＡＶウイルスを用いて以下のようなＩｎ ｖｉｔｒｏ動物実験を行う予定である。
１. ラットでエンドトキシン(リポポリサッカライド：ＬＰＳ)肺傷害モデルを作成し、ＬＰＣＡＴの発現・活性を明らかにするとともにリゾリン脂質を含めた肺サーファクタント成分の変化を観察する。
２. ＡＡＶ-ＬＰＣＡＴウイルスを経気道的に前投与することでエンドトキシン肺傷害を抑制できるかどうかを明らかにする。肺傷害の程度は肺の炎症細胞数・サイトカイン量、酸素ラジカル/窒素ラジカル量、ホスフォリパーゼA2活性、肺組織傷害スコア、アポトーシス細胞数、動脈血酸素分圧、肺圧量曲線、肺サーファクタント量を指標にする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度までの研究計画は、１）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の作成、および２）ラットからの肺胞Ⅱ型上皮細胞の単離と分化機能を維持した新たな培養系の構築であった。これらはいずれも達成できた。しかし、ＡＡＶは293細胞内で増殖せず、同ウイルスの作成にはそのつど十分量のプラスミドと293細胞の培養が必要である。さらに次年度の研究計画Ｉｎ ｖｉｖｏ動物実験には大量のＡＡＶウイルスベクターが必要になることから、同ウイルスベクター大量生産のための予算を次年度に持ち越す必要が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度はラットへのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の経気管投与を開始するので、実験のつど大量の大腸菌培養、プラスミド作成、293細胞の培養増殖、293細胞からのＡＡＶウイルスの単離精製が必要となり、これらの実験に必要となるプラスミド精製キット、培養培地、滅菌プラスチック容器、ウイルス精製フィルターキットなどの消耗品の購入に使用する計画である。
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