2017 年度実施状況報告書

急性肺傷害におけるリゾリン脂質の解析と同アシル基転移酵素遺伝子導入の効果

研究課題

研究課題/領域番号	15K09234
研究機関	金沢医科大学
研究代表者	長内和弘金沢医科大学, 医学部, 教授 (70221158)
研究分担者	小林誠金沢医科大学, 医学部, 助教 (20460355) [辞退]
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2019-03-31
キーワード	急性肺傷害 / リゾフォスファチジルコリンアシル基転移酵素１ / アデノ随伴ウイルス / リポポリサッカライド
研究実績の概要	急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は治療法の乏しい、いまだに死亡率の高い呼吸器疾患である。その病態生理は急性肺傷害であり、炎症細胞由来のホスホリパーゼＡ２の作用によりリゾフォスファチジルコリンをはじめとする各種炎症惹起性リゾリン脂質が産生される。これらリゾリン脂質は炎症をさらに増悪させると推測されるが、ＡＲＤＳの病態生理における意義はかならずしも明らかにされてこなかった。リゾリン脂質アシル基転移酵素はリゾリン脂質に対しアシル基を転移し、元の安定なリン脂質に戻す作用がある。本研究は生体への抗原性の乏しく遺伝子導入に優れているとされるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、ＡＲＤＳ実験モデル肺に同酵素を遺伝子導入することで、ＡＲＤＳにおけるリゾリン脂質の役割を明らかにするとともに、ＡＲＤＳに新たな治療法の可能性を提供することを目的としている。肺細胞への親和性の高いとされる血清型ＡＡＶ6.2を新たに作成した。Ａ549細胞を用いてコントロールＡＡＶ6.2としてのLacZ酵素発現の確認を細胞染色の目視、およびフローサイトメーターによる定量解析を行った。同細胞へのリポポリサッカライド添加による細胞障害がリゾフォスファチジルコリンアシル基転移酵素（ＬＰＣＡＴ）１を組み込んだＡＡＶ6.2-ＬＰＣＡＴ１の導入により抑制されることを確認した。またラットに経気道的にＡＡＶ6.2-ＬａｃＺを投与し１週間後に気管支肺胞洗浄を施行し、炎症細胞を解析したが、コントロール（生食水）と差はみられず、炎症惹起性が無いことを確認した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由平成２８年度までにＬａｃＺおよびＬＰＣＡＴ１-ｃＤＮＡを組み込んだリコンビナントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）6.2の作成を終了した。またＩｎ　ｖｉｔｒｏ実験に必要なラット肺胞II型上皮細胞を単離し、インサートウェル内での気相培養法を行い、肺胞II型上皮細胞の分化機能を維持した培養法を確立した。Ａ５４９細胞を用いたリポポリサッカライド（ＬＰＳ）による細胞障害をＡＡＶ６．２-ＬＰＣＡＴ１導入により抑制されることを確認した。しかし、ＡＡＶ６．２-ＬＰＣＡＴ１感染細胞におけるＬＰＣＡＴ１活性発現の確認をアイソトープを用いた実験で解析する必要があったが、アイソトープ実験施設の利用が工事のため中断しなければならなかったので、実験に遅延が生じた。すでに工事は終了したので、これからは順調に実験計画を進められると見込まれる
今後の研究の推進方策	実験が遅れていたアイソトープを用いたＡＡＶ6.2-ＬＰＣＡＴ１感染細胞におけるＬＰＣＡＴ１活性発現の確認実験を進める。ＡＡＶ6.2ウイルスの大量作成プロトコールを完成させているのでこれにしたがってＡＡＶ6.2-ＬacＺおよびＡＡＶ6.2-ＬＰＣＡＴ１を大量に作成する。ラットを用いて同ＡＡＶ6.2を経気道投与し１週間後に、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を経気道的に投与して急性肺障害を作成し、ＡＡＶ6.2-ＬＰＣＡＴ１による急性肺傷害抑制作用を確認する。以上によりＬＰＳ急性肺傷害におけるリゾリン脂質の解析と同アシル基転移酵素遺伝子導入の効果に関するＩｎ　ｖｉｔｒｏおよびＩｎ　ｖｉｖｏの実験を完成させる。
次年度使用額が生じた理由	本学病院中央棟の建設工事に伴い臨床研究棟ＲＩ実験室が使用不可となり、実験設備を基礎研究棟に移したため、実験の一部（アイソトープ使用実験）に遅延が生じてしまった。このため遅延した実験に必要な物品費の購入が遅れてしまい、次年度での使用額が生じてしまった。次年度はアイソトープ実験の遂行とこの実験結果を踏まえたＩｎ　ｖｉｖｏの動物実験を完了させる予定である。