| 研究課題/領域番号 |
15K09264
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
村上 太一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 助教 (30403736)
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| 研究分担者 |
松浦 元一 徳島大学, 病院, 特任助教 (10403734)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ApolipoproteinL1 / high density lipoprotein / 酸化ストレス / 腎臓病 / メタボリック症候群 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト検体：健常者および腎臓病患者各100症例でELIZAにより血中ApoL1発現量を測定し、血圧、腹囲、血液・尿生化学項目のうち相関する因子の同定を行った。結果は健常者群において血中ApoL1発現量は中性脂肪、空腹時血糖、収縮期・拡張期血圧、腹囲と正相関、HDLコレステロール、アディポネクチンとは負相関を認めた。正相関因子はメタボリック症候群（Mets）の診断基準に含まれる。メタボリック症候群診断基準となる腹囲85ｃｍ以上（男性）、90㎝以上（女性）の症例において、脂質、血糖、血圧いずれの基準も満たさない群（非Mets群）と三項目中一つ以上の基準を満たす群（Mets群＋Mets予備群）に分類すると、Mets群＋Mets予備群で有意に血中ApoL1は高値を示した。一方腎機能、尿中アルブミン量とは有意な相関を認めず、腎臓病患者においては血中ApoL1発現量と脂質、血糖、血圧等との相関は認めなかった。また両群いずれにおいても血中ApoL1発現量と酸化ストレスマーカーの尿中8OHdGとは有意な相関は示さなかった。以上、健常者において脂質、血糖、血圧などメタボリック因子と血中ApoL1と相関を認め、Metsの診断マーカーとなる可能性が示された
APOL1トランスジェニックマウス（Tg）：雄の対照マウスおよびヘテロ、ホモAPOL1Tgにおいて、酸化ストレスマーカー（尿中8OHdG）の測定、ネフローゼ症候群モデルにおける尿蛋白量を定量しその効果を検討した。8週齢マウスにおいて尿中8OHdGは対照マウスとTgにおいて有意な差は認めなかった。またネフローゼ症候群モデルを用いた予備実験でTgで尿蛋白の減少を認めたが、今回の追試験では再現性は確認できなかった。一方で対照マウスとの比較で8週齢以降糖負荷試験によりTgで有意に高血糖を呈すること、16週齢以降有意に体重が増加することが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではヒト検体およびAPOL1 Tgを用いて血中ApoL1の機能を解明することを目的としている。マウス予備実験の結果からApoL1蛋白の腎保護効果が想定されたため、マウスで追試を行いつつ、ヒト検体で血中ApoL1と相関する因子の同定を試みた。結果は当初の想定とは少し異なるものではあるが、ヒトデータにおいて血中ApoL1発現量は中性脂肪、空腹時血糖、収縮期・拡張期血圧、腹囲と相関することが明らかとなり、血中ApoL1がメタボリック症候群のマーカーとなり得ることが分かった。これらの結果はこれまで報告されていない新たな知見であり、血中ApoL1機能解明にあたり極めて重要な結果である。加えてAPOL1 Tgでは高血糖および肥満を呈することも判明しつつある。ここまでのヒトおよびマウスデータからは血中ApoL1には血糖を上昇させ肥満を呈する作用があり、メタボリック症候群の原因となりうる因子である可能性が示唆された。最終的にはAPOL1 Tgにおいてインスリン分泌能に焦点をあてて高血糖、肥満を来たすメカニズムを明らかにするとともに、ヒト検体においてもインスリン等の追加測定により血糖上昇機序の解明を行っていく。またApoL1がhigh density lipoproteinアポ蛋白であることから、リポ蛋白組成やアポ蛋白プロファイルを行うことで、APOL1 Tgの表現型を解析していく。これらの実験予定については既に研究協力者と計画済みであり、研究は概ね順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(ヒト臨床サンプルを用いた血中ApoL1発現量と相関する因子の同定）
これまでのヒト検体解析結果で血中ApoL1はメタボリック症候群の診断マーカーになりうる可能性が示唆された。糖代謝異常の観点からは、メカニズム解明のために血中インスリンや遊離脂肪酸、ＴＮＦαなどを追加測定によりインスリン分泌能や耐糖能異常との関連を明らかにしていく。またHDLアポ蛋白であるApoL1の発現量とHDLコレステロールが負の相関を示すことが明らかになった。これは機能解明には重要な鍵となる知見と考えられる。この逆説的な現象の説明として、血中ApoL1はその発現量増加に伴い発現の局在がリポ蛋白間で変化がおこり、糖脂質代謝へ影響を及ぼす可能性が考えられる。そのため高ApoL1/低HDLコレステロール群と低ApoL1/高HDLコレステロール群においてゲル濾過によりリポ蛋白を分画しApoL1の局在変化の有無を明らかにしていく。
(APOL1トランスジェニックマウス（Tg）を用いた血中ApoL1の機能解析）
APOL1 Tgにおいて高血糖を来たすメカニズムとして耐糖能異常もしくはインスリン分泌能低下のいずれかが考えられる。
そこで空腹時およびブドウ糖負荷時の血中インスリンを測定することで耐糖尿異常もしくはインスリン分泌能低下のいずれが原因であるかを明らかにしていく。耐糖能異常であれば肝、筋肉、脂肪での重量変化やインスリンシグナル変化を検討することで、その原因は明らかとする。インスリン分泌低下であれば膵ラ氏島の機能異常や萎縮の有無を評価していく。またAPOL1 TgではHDLでのApoL1過剰発現によりリポ蛋白の機能を担うアポ蛋白発現が変化する可能性が考えられる。そのためマウス血清をゲル濾過によりリポ蛋白分画毎に分離し、質量分析によりリポ蛋白プロファイルを行い、APOL1 Tgにおけるリポ蛋白機能変化を解明していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度において使用するTgの個体化・搬入の過程が遅れたことにより実験推進のための試薬・物品購入が遅くなったことが影響して、次年度使用金が発生した。また、Tg を用いるin vivo実験結果が当初の仮説と異なった結果となり、さらにはAPOL1機能解明に新たなデータが得られたため当該年度途中に研究計画の修正が必要となった。修正された研究計画に基づき必要試薬・物品の購入を行っている。加えて、修正された研究計画ではApoL1 Tgの週齢毎の経時的な基本データの採取が重要となるため、必要マウス個体数・サンプルが揃った段階で適時必要試薬・物品を購入している。これらも次年度使用金が発生した大きな理由として挙げられる。しかし、Tg導入の遅れや研究計画の修正はあったものの、研究推進に向けてマウス、ヒト検体ともに解析が進んでおり、前年度繰越金を加味しても概ね順調に資金の使用は進んでいる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前述したように、今年度の実験結果からヒト検体解析では血中ApoL1蛋白が血糖、脂質、血圧と相関を認めメタボリック症候群における主要因子である可能性が示唆された。次年度ではさらに血中ApoL1蛋白とインスリン分泌、遊離脂肪酸、アディポカインとの関連を解析していく。ApoL1のリポ蛋白分画間の局在変化が糖、脂質代謝における機能と関連していると推測している。そのためゲル濾過によりリポ蛋白を分画しApoL1の局在変化の有無を検討していく。また、マウスにおいては対照マウスとの比較でTgでのインスリン分泌能を評価するとともに、ゲル濾過により分画したリポ蛋白のアポ蛋白プロファイルを行いTgにおけるリポ蛋白機能を明らかにしていく。これらの実験に関わる試薬、物品購入、また研究協力者との打ち合わせ等々に使用する。
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