研究課題
AQP2はバソプレシン(VP)刺激により複数のリン酸化部位が修飾され管腔側膜へ移動するが、この複数のリン酸化部位の制御は、1)個別に独立して制御され、別の分子的意義があるのか、2）同一分子上で連続的に起こり、協調的にAQP2の細胞内輸送を制御するのか不明である。このことの解明はAQP2研究において根本的に重要な意義を持つと考えた。リン酸化特異的な免疫沈降法を確立することに成功し、AQP2の急性期リン酸化制御の複合的様相を検出する解析法の構築に応用した。それによりどのようにAQP2が複合的にリン酸化/脱リン酸化を遂げるかを検討し、刺激直後の変化を培養細胞及びマウス腎臓で現在進行形的に解析した。具体的にはpS256陽性AQP2、またはpS269陽性AQP2を単離し、pS261の変化を検討した。その結果pS256-pS261-AQP2上でSer-269がリン酸化されpS256-pS261-pS269-AQP2になり、その後にSer-261が脱リン酸化されてpS256-pS269-AQP2と変化してゆく様態を明確にすることができ論文発表した。この方法を尿崩症変異体であるP262L-AQP2に応用した。この変異体ではSer-261のリン酸化制御が逆転するが、その現象はpS256陽性AQP2上で起きていることを明確にした。また共免疫沈降への応用のためFLAG-AQP2とFLAG-P262L-AQP2強発現細胞株を樹立し、複合的リン酸化制御を確認した。またSer-269リン酸化、Ser-261脱リン酸化がWnt5a-calcineurinにより制御される研究にも協力し報告した。
2: おおむね順調に進展している
AQP2の複合的リン酸化制御を明確にすることができた。Ser-261の制御機構の解明がAQP2の細胞内輸送において重要であることをさらに明確に出来た。この複合的制御のビジョンは今までは世界的にもSerをAlaやAspに変えた人工的模倣体での検討が主流で、Ser-261はpS256, pS269の制御機構とは関係なく、AQP2細胞内輸送にも関係ないという考えが主流だったことを考えると本研究の意義は今後増すことが期待できる。また着目しているP262L-AQP2のリン酸化制御の異常についても複合的に解析することができ、今後の研究展開の重要な情報を得た。またその制御因子としてcalcineurinを同定した研究にも貢献することが出来た。
FLAG-AQP2とFLAG-P262L-AQP2の相互作用分子を網羅的に解析し、Ser-261脱リン酸化機構を明らかにし、calcineurin阻害剤などの分子的作用機序を明らかにしてゆく。
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Biochemical and Biophysical Research Communications
巻: 482 ページ: 524-529
10.1016/j.bbrc.2016.11.118.
Nature Communications
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http://www.tmd.ac.jp/grad/kid/
