| 研究課題/領域番号 |
15K09301
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| 研究機関 | 明治薬科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 成 明治薬科大学, 薬学部, 研究員 (60170677)
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| 研究分担者 |
田中 靖子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
石橋 賢一 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (80223022)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アクアポリン / 尿濃縮 / 腎臓 / 水電解質 / バソプレシン |
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| 研究実績の概要 |
アクアポリン-2 (AQP2)は尿濃縮を司る腎臓の水チャネル蛋白質であり尿中へ排泄され、疾患マーカーとして期待されている。しかしその詳しい分泌動態や生理的意義は不明である。ヒト健常人の尿とヒトAQP2発現培養細胞を用いて研究を行い、以下の結果を得た。
１。尿AQP2の大部分は細胞外小胞(EV)に存在する: ヒト尿AQP2 ELISAキットを使用して、原尿、3000g遠心後、200,000g遠心後の尿AQP2濃度を測定したところ、3000gで沈殿する細胞断片などには1.5%しか存在せず、200,000gで沈殿する膜分画に98%以上が存在していた。この膜分画はWestern blotでAQP2, TSG101, ALIX, b-actin, ENaC, CD9, CD63が認められ、EVであることが示された。このEVについて抗AQP2抗体で共免疫沈降を行ったところ、CD9、TSG101の共存を認め、AQP2がexosomeに存在することが確認された。
２。EVの形態： ヒト健常人の尿より超遠心法でEVを分離し、電顕で観察したところ、10-100nmの小胞が多数認められた。この小胞は-25℃とアルカリ処理で破壊され、この結果はELISAでの尿AQP2測定時に、-25℃あるいはアルカリ処理の事前処理が必要なことと一致する。
３。分泌動態： ヒトAQP2の安定発現MDCK細胞を透過性を有する膜（Transwell）に培養すると、アピカル側の培養液にAQP2の分泌が認められた（10倍の濃度較差）。さらに分泌刺激としてForskolin(10nM)あるいは高浸透圧(100mM NaCl)を添加したところ、高浸透圧刺激で有意の上昇が認められた。以上より、尿AQP2のほとんど全てが、尿中のexosomeに排出され、高浸透圧刺激に反応性であることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通りに進行している。Exosomeを破壊する方法が見つかったので、抗AQP2抗体による共免疫沈降が可能となり、網羅的蛋白解析が進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．AQP2を多く含むヒトの尿中エキソソームの性質をについて、共存蛋白の網羅的解析を行い、他のエキソソーム（具体的にはCD9で免疫沈降したもの）と比較することにより特性を明らかにする。
２．昨年度は永続的にAQP2を強制発現する細胞を使用したが、今年度はより生理的でバソプレシン刺激に反応性があるmpkCCD細胞で実験を行う。特にバソプレシン投与により、AQP2のアピカル膜への移動が起こる短期間（３０分以内）で分泌増加が起こるかを明らかにする。浸透圧刺激との差異も検討する。また、エクソソームの形成阻害剤を投与し、阻害前後でバソプレシン刺激を行い、AQP2の細胞内動態の変化を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究は計画に従って順調に進展しており、予算使用も予定通りであった。生じた差額は総額の1％以下の10,561円と軽微であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度も当初の予定通りに研究を進め、今年度の差額10,561円は物品費に充てる予定である。
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