| 研究課題/領域番号 |
15K09301
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| 研究機関 | 明治薬科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 成 明治薬科大学, 薬学部, 客員研究員 (60170677)
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| 研究分担者 |
田中 靖子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
石橋 賢一 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (80223022)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アクアポリン / エクソソーム / 尿濃縮 / 水透過性 / 水チャネル / バソプレシン |
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| 研究実績の概要 |
アクアポリン－２（AQP2）は尿濃縮を司る水チャネル蛋白質であり尿中へ排泄され、疾患マーカーとしても期待されている。しかしその詳しい分泌動態や生理的意義は不明である。昨年度までに尿AQP2の約９割が細胞外小胞（EVs）に存在し、免疫抗体で尿AQP2を検出するにはEVs膜を破壊する必要があること、またAQP2強制発現細胞を使用しアピカルの分泌液にAQP2分泌を再現できることを明らかにした。
今年度は1）EVs膜がアルカリ処理あるいは凍結融解で破壊されることを電顕で観察し、また使用した抗体のエピトープがEVs内側であることを２つの論文として発表した（Clin Exp Nephrol. 2016; 20:450-5, Int J Mol Sci. 2016; 17:E1634）。2）破壊したEVs膜をAQP2抗体で免疫沈降し、LC-MS/MS解析を行ったところ、137個の蛋白質が同定され、そのほとんどが集合管に存在し、Pathway解析ではendocytosis pathway蛋白(TSG101、CHMP4、ALIX、VPS4など) が主体であった。3）AQP2が濃縮されている尿EVs(160,000g分画)を用いてstopped-flowにより水透過性を測定したところ、4.75 ± 0.38 × 10-4 cm/sと小さいが、温度依存性が少なく水銀で抑制され、サンプル中のAQP2濃度と相関していた。4）AQP2発現MDCK細胞ではforskolin刺激3時間までAQP2分泌は一定であり、短期効果は認められなかった。
以上の結果より、尿AQP2はendocytosis/exosome由来であり、水チャネル機能を保持し、分泌はVPの長期効果の影響が強いと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Cvs膜をアルカリ処理あるいは凍結融解で破壊できるを示し、EVs内側のAQP2抗体エピトープに結合するAQP2抗体での免疫沈降に成功した。懸念された技術的問題を解決することができ、137個もの共存蛋白を明らかにした。
In vitroのAQP2発現系では、AQP2-MDCK細胞での長期効果の優位性を示すことが出来たが、さらに内因性にAQP2を発現するmpkCCD細胞でも同じ結果が得られる検討している、
以上、in vivo、in vitroの系で予定通り研究は進展している。EVsの水透過性の測定は当初の予想以上の成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在の研究を続け成果を論文としてまとめる。
1）In vitroでは内因性にAQP2を発現するmpkCCD細胞において、バソプレシンのAQP2分泌に対する効果を３時間まで観察する。増加するAQP2はs256, s261, s269のどのリン酸化が主体かも明らかにする。
2）In vivoでは中枢性尿崩症患者へのバソプレシン投与時の尿AQP2排泄の時間経過を調べ、同時にどのリン酸化が目メインかを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画は想定以上に順調に進み、消耗品の使用が少なく済んだ。しかし、今後成果の論文化におけるオープンアクセス経費の増加が予想される。
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| 次年度使用額の使用計画 |
予定通りに研究を進め、成果をオープンアクセスとして論文化していく。
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