| 研究課題/領域番号 |
15K09308
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
荒若 繁樹 山形大学, 医学部, 講師 (00344789)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経内科学 / 病態生化学 / 神経変性疾患 / パーキンソン病 / 動物モデル / α-シヌクレイン |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、パーキンソン病治療におけるアデノシンA2a受容体抑制の神経保護作用を明らかにすることを目的としている。アデノシンA2a受容体ノックアウトマウス脳にα-シヌクレインを発現させることにより、α‐シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞変性および炎症細胞の集簇に対するアデノシンA2a受容体抑制の効果を解析する。α‐シヌクレインの発現は、２つの方法で行う。ひとつはアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて黒質ドパミン神経細胞にA53T変異型α‐シヌクレインを発現させる。もうひとつは、予め調製しておいたα‐シヌクレイン凝集物をマウス線条体に接種し、α‐シヌクレインのプリオン様伝播を引き起こさせる。これらの動物モデルにおいて、運動機能、ドパミン神経細胞の脱落、ミクログリア・アストロサイト集簇の変化を経時的に評価する。
平成27年度は、実験に用いる材料の準備を行う予定であった。具体的には、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの準備とα‐シヌクレイン発現用AAVの調製を行動計画とした。本実験では、ノックアウトマウスの効果を明らかにするために野生型マウスと比較しなくてはならない。購入したアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの遺伝背景をC57BL/6に戻し交配を繰り返して変換している。また、AAVは血清型9が効率よくマウスのドパミン神経細胞に感染することが報告されている。当初の計画では、従来使用していた血清型2のAAVを使う予定であった。しかし、α‐シヌクレインを高効率でドパミン神経細胞に発現させることが重要なため、従来の血清型2から血清型9のAAVを使用する方針に変更した。現在、AAVべクターを改変する作業を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本実験では、対照コントロールとして野生型マウスが必要である。そのため、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスの系統を、入手しやすい野生型マウスと揃えなくてはならない。C57BL/6系統との交配を５回予定しているが、交配に時間がかかっている。また、マウス脳で目的遺伝子をより高く発現させるため、従来の血清型２のアデノ随伴ウイルスから血清型9に変換する作業を進めている。血清型9のベクターは市販されていないことからベクター構築及びウイルスの作製に時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、ノックアウトマウスの戻し交配が終了し、血清型9のアデノ随伴ウイルス（AAV）の準備が出来次第、動物実験に取り掛かる予定である。はじめに、血清型9のAAVの効果を野生型マウスの黒質に接種して、α‐シヌクレインがどの程度ドパミン神経細胞に発現されるか明らかにする。ウイルス接種後、2から4週目で脳を採取し、評価を行う。α‐シヌクレインの発現が思わしくない場合、従来の血清型2に切り替える。これらの予備実験をふまえて、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスを用いた本実験へ進む。マウスの黒質にAAVを接種し、シリンダーテストで運動機能を評価し、採取した脳を用いて免疫組織学的に残存するドパミン神経細胞数を定量的に計測する。また、ミクログリア・アストロサイトの集簇を組織学的に評価する。これらの実験が終了したら、プリオン様伝播を引き起こさせたノックアウトマウスの解析に移る。
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| 備考 |
平成27年度の研究成果は、アップロードの予定です。
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