| 研究課題/領域番号 |
15K09331
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター |
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研究代表者 |
上山 盛夫 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第四部, 科研費研究員 (20386593)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / 前頭側頭葉変性症 / 異常伸長リピートRNA / リピート関連非ATG翻訳 / ショウジョウバエ |
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| 研究実績の概要 |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)と前頭側頭葉変性症(FTLD)は、難治性の神経変性疾患であり、治療につながる病態解明が切望されている。近年、家族性および孤発性ALS/FTLD患者の最も高頻度な発症原因としてC9ORF72遺伝子非翻訳領域にGGGGCCリピートの異常伸長が発見された。この異常伸長リピート由来のRNAはリピート関連非ATG翻訳(repeat-associated non-ATG translation: RANT)により凝集性を持つジペプチドリピート(DPR)蛋白質として翻訳されることが報告された。さらに、DPR蛋白質が神経変性を引き起こすことから、RANTの関連分子群(マシナリー)を含むメカニズムの解明は、ALS/FTLDの病態解明につながると考えられるが、RANTメカニズムは未解明である。
本研究では、RANTメカニズムの解明を目的とし、DPR蛋白質を発現するC9ALS/FTLDモデルショウジョウバエを用いて、複眼神経変性を指標として遺伝学的スクリーニングによりRANTマシナリーの同定を試みた。具体的には、DPR蛋白質を発現するC9ALS/FTLDモデルショウジョウバエは強い複眼神経変性を呈するが、この表現型に対して新たな遺伝子過剰発現やノックダウンが効果を及ぼすかどうかを検討した。
今年度はATG依存性翻訳やmRNA品質管理に関わる遺伝子などRANTマシナリーとして関与が予測される10遺伝子について候補遺伝子スクリーニングを行った。それぞれの遺伝子について複数の過剰発現およびノックダウン系統を利用してスクリーニングを行ったが、DPR蛋白質発現による複眼神経変性を変化させる遺伝子は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
スクリーニングに用いるC9ALS/FTLDモデルショウジョウバエが強い複眼神経変性を呈するだけでなく、致死率が高くスクリーニングに必要な個体数を得るのが困難なため、計画当初に予定していたゲノムワイドな遺伝学的スクリーニングが困難であることが判明した。そこで候補遺伝子スクリーニングを行った。
また今後必要となるRANT産物であるDPRタンパク質を認識する抗体を用いた免疫組織染色およびウェスタンブロット(WB)の条件検討をおこなったが、DPRタンパク質を認識する3種類の抗体ともWBはうまく行うことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
スクリーニングについてはこれまで利用していた系統よりも複眼神経変性が弱いC9ALS/FTLDモデルショウジョウバエを用いて行う。
RANT産物であるDPRタンパク質を検出は基本的に抗体を用いた免疫組織染色のみで行い、並行してWB条件のさらなる検討およびドットブロット法など別の生化学的検出法を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
全ゲノムを対象とした遺伝学的スクリーニングに利用するストック購入をしなかったことと、それに必要な消耗品購入も少なくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
スクリーニング方法を改善し、それに伴って今年度必要であったストックを購入する。また、WBの検討を行う上で今年度購入した抗体とは異なるものを購入する。
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