| 研究課題/領域番号 |
15K09373
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
藤田 征弘 旭川医科大学, 医学部, 助教 (20451461)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | グルカゴン / 膵島 / 測定法 |
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| 研究実績の概要 |
膵島α細胞と分泌ホルモンであるグルカゴンが、糖代謝のkey modulatorとして再注目されている。α細胞の研究には、生理的培養細胞株がないことや測定法の交差性など課題が多い。本研究の目的として、受容体結合に基づくバイオアッセイ法を確立し、糖尿病状態でのグルカゴン分泌を再検証する。加えて糖尿病状態でのα細胞の数量的・機能的異常や増殖能亢進のメカニズムの機序を探究する。我々の研究室では、グルカゴン、GIP、GLP-1各受容体とそのシグナル下cAMP量に反応し、ルシフェラーゼを発現する（Luc-Cre）を共発現する培養細胞(HEK293)を確立している。昨年の報告でグルカゴン受容体のアッセイではGIPやGLP-1によって受容体活性が活性化されないことを報告したが、追加検討でプログルカゴン遺伝子産物のオキシントモデュリンがかなりグルカゴンと同じぐらいの受容体刺激活性を持つことが明らかになった。一方で、GLP-1受容体は、GLP-1>オキシントモデュリン>グルカゴンの順で活性化することが明らかになった。
次に正常耐糖能者(n=9)および、２型糖尿病患者DPP-4阻害薬未使用群(n=7)、２型糖尿病患者DPP-4阻害薬使用群(n=9)にミール負荷試験（MTT)を行った。グルカゴン測定には、市販されているELISAキットも使用し比較検討した。DPP-4阻害薬使用群でΔiAUCグルカゴンは我々の測定系では低下を認めたが、市販のキットでは低下を認めなかった。
プログルカゴン遺伝子のプロモーター下に蛍光タンパクを発現するmGluVenusからVenus陽性細胞の分取に取り掛かっている。小腸をコラゲナーゼ処理した細胞をフローサイトメトリーにかけて蛍光タンパク陽性の細胞群を採取可能となっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
正常耐糖能者や入院2型糖尿病患者にミールテストを行い、バイオアッセイによるインクレチン測定とともにグルカゴン測定も測定しており、学会発表を行ったり、今後論文か予定である。
また外来患者においては、正常耐糖能者、耐糖能異常者、２型糖尿病患者をリクルートしてミール負荷試験をすで十分数の対象者に施行している。現在、各アッセイについて逐次測定中である。
一方、グルカゴン産生細胞の詳細な検討を行うため、グルカゴンプロモーター下に蛍光タンパクのYFPを発現するマウスを飼育しているが、現在実験に十分数のホモ接合体のマウスを維持飼育している。小腸からの細胞分取が可能となり、膵島を含む他の臓器からの分取に取り掛かっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）正常状態、糖尿病状態における膵外からのグルカゴンの役割を探究する
消化管粘膜からえられたYFP陽性細胞を初代培養し、さまざまなブドウ糖、アミノ酸、インスリン，インクレチンの濃度の条件で、培養液や細胞抽出液を回収してグルカゴン受容体活性化能に基づいた測定法で測定する。糖尿病状態での変化を、mGluVenus-STZ マウスまたはmGluVenusをAkitaマウスなど自然発症マウスに交配し、上記の方法で検討する。
２）糖尿病状態のおけるα細胞の機能的異常や増殖能亢進のメカニズムを探究する。
mGluVenus-STZマウスよりYFP陽性α細胞を回収し、RNAを抽出し、遺伝子発現の変化をmicroarray法で網羅的に解析する。グルカゴン遺伝子の転写にかかわる転写因子(MafB、Arx、PAX6)やプロセッシングに関わる因子(PC2、PC1/3)、細胞周期にかかわる因子(Cyclin D)を中心に解明する。また、α細胞の質的な変化、PC1/3発現によるGLP-1やGIP産生がどのようなシグナルで起こるか検討する
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| 次年度使用額が生じた理由 |
他の研究費で充当できたため。
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