| 研究課題/領域番号 |
15K09439
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
山口 秀樹 宮崎大学, 医学部, 講師 (10305097)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 生理活性ペプチド / 糖尿病 / インスリン / 膵β細胞 |
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| 研究実績の概要 |
グラニン由来新規生理活性ペプチドであるNeuroEndocrine Regulatory Peptide (NERP)-4の生理作用を明らかにするため、NERP-4抗体を用いたマウス膵における細胞内局在、MIN-6培養細胞株やマウス単離ラ氏島を用いたNERP-4のインスリン分泌作用を検討した。
NERP-4は、蛍光染色法による解析で膵ラ氏島に局在し、外分泌細胞には認めなかった。蛍光二重染色法にて、NERP-4陽性細胞はインスリン陽性細胞と多数共存を認めた。NERP-4の一部はグルカゴンと共存するも、ソマトスタチンとは共存しなかった。
培養細胞株MIN-6細胞株培養液中にNERP-4を添加した結果、NERP-4は高グルコース条件下でインスリン分泌を促進した。低グルコース培養条件下では、NERP-4のインスリン分泌促進活性は認めなかった。
野生マウス膵からラ氏島を単離培養し、NERP-4のインスリン分泌活性を検討した結果、高グルコース条件下でのみ単離ラ氏島からのインスリン分泌を促進した。NERP-4は用量依存性にインスリン分泌を促進し、最小活性濃度は10-10Mであった。
以上より、新規グラニン由来ペプチドであるNERP-4はマウスラ氏島のβ細胞やα細胞に局在し、インスリン分泌を促進する新たな生理活性ペプチドであることを明らかにした。今後、NERP-4の糖尿病モデル動物での動態を検討し、摂食エネルギー・糖代謝調節機構におけるNERP-4の位置づけを明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者を含む研究グループは多数の生理活性ペプチドの研究で、(1) ラットおよびマウス個体での行動薬理学的解析技術、(2) 摂食関連ペプチドおよび神経伝達物質の定量技術、(3) ペプチドやその受容体の形態学的解析技術、(4) 細胞培養技術と情報伝達機構の解析技術を確立しており、その実績を基に順調に研究を遂行している。実験支援生物資源分野（動物実験施設）、RI部門、組織培養部門など研究実施のために使用する研究施設・設備など現在の研究環境に問題はない。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、H27年度で得られた研究実績をもとに、以下の実験計画を行う。
平成28年度は、1) NERP-4のインスリン分泌に及ぼす影響と他の消化管ペプチドとの機能連関（山口が担当）を実施する。NERP-4をラット静脈内に投与後、体循環へのインスリン分泌量を検討する。グレリンやGLP-1のような他の消化管ホルモンのラットにおけるNERP-4の産生と分泌に対する影響を解析し、NERP-4と他の消化管ホルモンとの機能連関を明らかにする。in vivo 実験では、肥満（db/db mice）と非肥満 (Akita mice)の２型糖尿病モデルマウスを、NERP-4を使って治療する。2）NERP-4の摂食関連ペプチド分泌調節への関与と細胞内情報伝達機構の解明（山口が担当）を実施する。NERP-4の摂食関連ペプチド分泌調節機構への関与を明らかにするため、培養細胞株や神経核初代培養系を用いて、NERP添加後の内在性ペプチドの分泌動態を検討する。
平成29年度は、1）NERP-2,-4(NERPs)受容体の探索（山口が担当）を実施する。NERP受容体を探索するためNERPs投与で内在性ペプチド分泌が制御される培養細胞株を用いる。オートラジオグラフィーを基にcDNAライブラリーを作製し、発現クローニング法を用いてNERPs受容体のクローニングを行う。2) NERPs以外の新規グラニン由来ペプチドの定量系の開発、生体内分布・細胞局在（山口が担当）を実施する。同定したペプチドをFmoc法を用いたペプチド合成機で化学合成し、HPLCや質量分析計で検証する。C端のペプチド片をヘモシアニンと結合させ、家兎に免疫して特異抗体を作製する。放射性ヨードでラベルしたペプチドを用いて、高感度RIA系を開発する。この特異抗体を用いて、新規ペプチドの組織含量、血中濃度を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験動物の購入数が、有意差が得られたため、当初の予定数より少なく購入したことのよる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に、長期作用を検索するため高価なペプチド購入費に充てる。
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