2016 年度実施状況報告書

新たな活性検出法を用いた新規生理活性ペプチドの同定による新しい生体調節機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	15K09445
研究機関	国立研究開発法人国立循環器病研究センター
研究代表者	森健二国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (00416223)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	生理活性ペプチド / 神経ペプチド / Gタンパク質共役型受容体
研究実績の概要	生理活性ペプチドは、細胞間の情報伝達を担う主要な分子であり、生体機能の調節において広範かつ重要な役割を果たしている。故に、新規生理活性ペプチドの発見とそれに続く機能解析により、新しい生体調節機構を明らかにすることができる。研究代表者の所属する研究室では、生理活性ペプチドの活性を検出するアッセイ法を新たに開発・導入することによって、数多くの新規生理活性ペプチドを継続的に発見してきた。具体的には、1980年代前半の平滑筋の弛緩・収縮アッセイの開発により3種類のナトリウム利尿ペプチドと６種類のニューロメジンを、1990年代のcAMPのラジオイムノアッセイの導入によりアドレノメデュリンを、近年ではオーファンGタンパク質共役型受容体（GPCR）の内因性リガンド探索によりグレリンとニューロメジンSを発見してきた。これらの事実から、新しい活性測定法の導入が新規生理活性ペプチド発見の契機となっていることがわかる。これまで、オーファンGPCRの内因性リガンド探索により十数種類の新規生理活性ペプチドが同定されているが、現在でも内因性リガンドがペプチドであると推測されるオーファンGPCRが数十種類存在しており、これまでの探索に用いてきたGPCR活性化測定法（細胞内カルシウムイオン濃度もしくはcAMP濃度の変動測定）ではリガンドを同定することができていない。そこで、三量体Gタンパク質G12/13シグナル伝達系の活性化を指標とした探索と、高感度なGPCR活性化測定法（CellKeyシステム）を駆使した探索、イノシトール1リン酸の産生量を定量することによる探索系を新たに構築して、オーファンGPCRの内因性リガンド探索を実施している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由オーファンGPCRの内因性リガンドを同定できていないので、達成度を“やや遅れている”と評価した。本研究では、これまで内因性リガンドの探索に適用されたことのない三量体Gタンパク質G12/13シグナル伝達系の活性化を指標とした探索と、高感度なGPCR活性化測定法（CellKeyシステム）を駆使した探索、およびイノシトール１リン酸を定量することによる探索系を導入して、複数のオーファンGPCRの内因性リガンド探索を実施したが、残念ながら未だ同定できていない。一方、研究代表者はこれまでタンパク質の配列情報から新規生理活性ペプチドを2つ発見しているがこれらの受容体はまだ同定されていない。そこでこれらのペプチドがオーファンGPCRのリガンドとして機能するかを検討している。
今後の研究の推進方策	ラットもしくはブタの各種組織より抽出したペプチド画分や様々な培養細胞の培養上清を材料としてオーファンGPCRの内因性リガンドとなる新規生理活性ペプチドを探索したが、その活性を同定することができなかった。その一つの原因としては、目的のリガンドが極微量しか存在しないことが考えられる。そこで、アッセイに供するサンプル量を増やすことにより対応する。また、これまでペプチド画分を抽出したことのない動物組織からのサンプル調整も実施する予定である。これらにより特異的なリガンド活性が検出できた際には、それを精製の後、構造を決定する。新規ペプチドを得た場合には、cDNAクローニングにて前駆体タンパク質の構造を決定するとともに、遺伝子発現分布などを解析する。一方、これまでに発見した新たな生理活性ペプチドの受容体を同定するために、オーファンGPCRのリガンドとして機能するかを検討する。また、このペプチドについても機能解析を実施する。
次年度使用額が生じた理由	次年度に使用する予定の研究費は、主に物品費と謝金として計画していたが使用しなかったものである。特に、物品費については必要最小限の消耗品の購入に充てたため、次年度使用額が生じた。翌年度は物品費として使用する予定である。
次年度使用額の使用計画	本研究計画では、国立循環器病研究センターの保有する共同研究機器ならびに、国立循環器病研究センター研究所生化学部の機器を中心に使用するため、研究を遂行するための物品費（消耗品）を中心として研究費の使用を計画している。また、最新の知識・情報を収集するための調査・研究旅費、ならびに成果発表に関する必要経費の使用も計画している。