| 研究課題/領域番号 |
15K09446
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
生田 克哉 旭川医科大学, 医学部, 講師 (00396376)
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| 研究分担者 |
進藤 基博 旭川医科大学, 医学部, 講師 (10396377)
伊藤 巧 旭川医科大学, 医学部, 特任助教 (80548686) [辞退]
土岐 康通 旭川医科大学, 大学病院, 医員 (90596280)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 鉄代謝 / フェリチン / ヘプシジン / 鉄感知機構 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、鉄過剰時に血清中に増加するフェリチンが、鉄代謝調節因子ヘプシジンを産生する肝細胞膜表面のトランスフェリン受容体との結合を介して、ヘプシジンの発現を調節する可能性と生体鉄感知機構の解明を目指すものである。
ヒトフェリチンはH-とL-subunitの2種類のsubunitが24個結合したheteropolymerを形成するタンパクであるが、平成28年度は各subunitの関与を個別に解析するため、H-およびL-subunit発現ベクターを各々作成し、human embryonic kidney (HEK) 293細胞にlipofection法にて遺伝子導入を行い、安定細胞株樹立を行った。各subunit強制発現HEK293細胞が樹立でき、mRNA発現亢進および細胞内フェリチン濃度亢進をreal-time法やwestern blotting法により確認した。さらに、これらの細胞を48時間培養した際の上清中への各フェリチンsubunit蛋白の放出も、自動分析装置やwestern blotting法で確認した。次に、これらの遺伝子導入HEK細胞の培養液を採取し、HepG2やHep3Bに添加し、各フェリチンsubunitが肝細胞のHAMP遺伝子発現に影響するかどうかをreal-time PCR法で検討しており、現在も継続中である。
さらに、鉄過剰モデルマウスでの、血清フェリチン、肝臓や脾臓などでのフェリチン遺伝子発現の変化、肝臓でのHAMP遺伝子発現変化の経時的な検討を開始している。
一方、ヒトフェリチンH-subunitには細胞膜表面のトランスフェリン受容体1(transferrin receptor 1: TfR1)に結合するという報告があるため、TfR1強制発現下でのHAMP発現を検討すべく、HepG2やHep3B細胞でのTfR1強制発現安定細胞株樹立を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度には、HepG2細胞株においてヒト脾臓由来フェリチン添加時にHAMP遺伝子発現上昇を認め、本研究の当初の仮説を裏付ける結果を得ていたが、平成28年度は、フェリチンの各subunitの作用を個別に検討するため、ヒト各subunitをコードするcDNAを哺乳類細胞での発現ベクターに組み込み、HEK293細胞に遺伝子導入し安定細胞樹立を行った。また、それらの細胞の培養上清中に各subunitが放出されることも確認し、これらの培養上清をヒト肝癌細胞株に作用させ、HAMP遺伝子発現亢進に作用しうるかどうかをreal-time PCRで検討した。実験間の値のバラつきが非常に大きい問題が生じているが、当初の予想のHAMP発現亢進を示す結果も得られており、繰り返しての安定した条件設定を継続していく予定である。
なお、マウスへ鉄剤を投与して鉄過剰モデルマウスを作成し、血清フェリチン値が十分に上昇する条件の設定も行っている。ただ、このような条件ではマウス血清中でトランスフェリンが飽和し、非トランスフェリン結合鉄NTBIが出現する可能性があり、それもmonitoringする必要が生じうる。特にNTBIは、血清フェリチン値との相関は弱く、鉄投与の際にin vivoでは非常にdynamicな変動をきたすことを我々は英文論文として平成28年度に報告し（Int J Hematol 2016）、本研究を進める基盤の一つを固めたと考えている。
一方、大腸菌での各subunit発現・精製に関しては、実験の承認に予想より時間を要したが、今後これらの計画を早急に進めていく予定である。
このように各実験間で進行度合いに差は生じているが、概ね仮説の証明に向け必要な解析を継続できていると考えている。さらに、今後の研究に必要となる基盤固めも同時に完了させており、研究全体としては概ね順調と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度には、フェリチン強制発現HEK293安定細胞株樹立が終了し、それらの培養上清を肝癌細胞株に添加しHAMP発現変動を検討したが、結果のバラつきが非常に大きい。HEK293から放出されているフェリチンsubunit量の変動が大きい可能性、また、肝癌細胞株のviabilityの変動が大きい可能性を検討しており、安定した条件設定での検討を目指す。さらに、HEK293にはendogenousなフェリチン発現もあるため、heteropolymerの構成比が実験間で大きく異なる可能性も残る。これに対しては、大腸菌でのフェリチン蛋白発現・精製を行ったうえでの検討も必要と考え、当院の規定に基づき届出の修正手続きを完了させたところであり（整理番号15-08-02）、早急に大腸菌でのヒトフェリチンH-およびL-subunit発現ベクター作成および蛋白の単離を目指し、それらを用いて肝癌細胞株でのHAMP発現変動の検討を行う予定である。
なお、マウスへ鉄dextranを投与して鉄過剰モデルマウスとし、血清フェリチン、肝臓や脾臓などでのフェリチン遺伝子発現、さらに肝臓でのHAMP遺伝子発現の経時的変化の検討を行っていく。
一方、フェリチン各subunitと細胞膜表面のTfR1の結合に関して分子モデリング・シミュレーション解析も施行したが、既報のようにTfR1はH-subunitとの結合が示されたが、L-subunitとの明確な結合を示す結果が得られず、各subunitの作用点が異なる可能性が考えられた。TfR1と共に生体鉄感知を行う可能性が指摘されるHFEやTfR2の関与の検討も併せて行っていく。加えて、HAMP遺伝子のpromotor領域の反応についてluciferase assayを用いた解析を加え、細胞外フェリチン濃度変化からヘプシジン発現変動に至る一連の動きの解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請した所要額2,051,637円に対して、必要物品を過不足なく購入した結果実際に使用したのが、1,924,028円であり、残額127,609円となった。予定より少額の利用となった理由としては、前年度からの繰越金があったこと、購入した物品の価格設定が変更になったことに加え、本年度も各種の検討において既に所有していた物品を効率よく活用することで予想より少ない物品購入で十分に研究が進展させられたことである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の残額127,609円は、平成29年度の研究継続のための物品費の一部として使用したい。特にフェリチン蛋白購入、ヘプシジン発現評価(real-time PCR)また、ヒトフェリチン蛋白を大腸菌で産生させ精製する際のカラムなど必要な物品に充てることで詳細な解析が可能となると考えている。
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