| 研究課題/領域番号 |
15K09451
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
勝見 章 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (80378025)
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| 研究分担者 |
丸山 光生 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, その他部局等, その他 (00212225)
天野 睦紀 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90304170)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Rhoファミリー / 脂質メディエーター / 血管老化 |
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| 研究実績の概要 |
我々はRhoA, Rac1, Cdc42などに加え、RhoH, Rac2等の血球特異的GTPaseをbaitにした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立した。この実験システムを用いて、我々はGTP結合型の活性型Rho family蛋白の一部にLOXが結合することを明らかにした。さらに複数の活性化Rho GTPasesと複数のLOX familyの結合の証明を試行中である。またGTP結合型Rho familyとLOXをCOS7細胞で共発現し、両者の結合を検討した。現在この結合が直接的なものか、既知のエフェクターを介したものかを検討中である。さらに相互の結合に必要なRho family LOXそれぞれのドメインの同定作業中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
準備段階として我々は既にRhoA, Rac1, Cdc42 などに加え、RhoH, Rac2 等の血球特異的GTPaseをbait にした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリーLC/MS-MS）の実験系を確立した。この実験システムを用いて、我々はGTP結合型の活性型Rho family 蛋白の一部にLOX が結合することを明らかにしており、さらに複数の活性化Rho GTPases と複数のLOX family の結合の証明を目的とする。次にGTP 結合型Rho familyとLOX をCOS7 細胞で共発現し、両者の結合を証明することができている。さらにRho familyのうち、LOXとの活性化依存性の結合が明らかになった分子につきそれぞれの阻害剤（ボツリヌス毒素、RhoA下流阻害剤Y-27632, Rac阻害剤NSC23766, Cdc42阻害剤ZCL278など）をCOS-7細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の産生が抑制されるかどうかをELISAで検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）GTPase の阻害薬によるLOX 下流脂質メディエーターの抑制効果の証明：LOX との活性化依存性の結合が明らかになったRho family 分子につきそれぞれの阻害剤（ボツリヌス毒素、RhoA 下流阻害剤Y-27632, Rac 阻害剤NSC23766, Cdc42 阻害剤ZCL278 など）を内因性のLOX が発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETE など)の産生が抑制されるかどうかをELISA で検討する。
２）動脈硬化モデルマウスの 動脈硬化局所での血小板由来12-LOX の役割：プラーク破裂に伴う血栓形成にはマクロファージや泡沫化した平滑筋細胞由来のtissue factor(TF)が重要な役割を果たす。我々は血小板中に存在する12LOX の脂質メディエーター12HETEを介した血小板凝集作用に注目した。動脈硬化マウスモデルとしてApoE ノックアウトマウスを購入する。Rho family またはその直下の阻害剤により動脈硬化部位での12LOX の細胞内局在の変化を免疫染色で、下流脂質メディエーターの活性低下をELISA で確認する。
3) 動脈硬化巣の病理学的比較ならびに脂質、炎症細胞の比較：同マウスモデルでRho family またはその直下の阻害剤の有無により、大動脈のOil-red O 染色での病理的比較、体重変化、血中総コレステロール、あるいtriglyceride 等の値を比較する。免疫機能関連的な視点からは動脈硬化がTh１タイプの炎症であるという側面からIFN-γ、IL-4 やIL-10, IL-18 等のサイトカインの変化をELISA で測定する。またマクロファージ数、遊走能を阻害剤の有無で比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において、アフィニティクロマトグラフィー、シグナル伝達実験はすべて所属機関および国立長寿医療研究センター研究所に設置されている機器および専門オペレーターによりデータを得ることができ、経費の削減ができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度は国立長寿医療研究センターにおいてシグナル伝達、マウス実験のために予算執行をしていく。
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