| 研究課題/領域番号 |
15K09451
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター |
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研究代表者 |
勝見 章 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 輸血管理部, 部長 (80378025)
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| 研究分担者 |
丸山 光生 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 研究所, 副所長 (00212225)
天野 睦紀 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Rhoファミリー / 脂質メディエーター / 血管老化 / アラキドン酸リポキシゲナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
我々はRho GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS)実験系を確立した。血小板細胞質分画をアフィニティーカラム精製することで我々は活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。既知のRhoAエフェクター (mDia, PKN1, Rho kinase, IQGAP2, Daam1, Daam2)に加えて、アラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoA(RhoA-L63)に結合することが見いだされた。RhoAとALOX12をCOS-1細胞内で発現したところ両者の直接の結合は認められなかった。一方でRhoAエフェクターDaam1とALOX12の結合がCOS-1細胞での発現実験で証明された。このことからALOX12はDaam1を介して活性型RhoAに結合することが判明した。さらにALOX12のLH2ドメインがDaam1のN末に結合することが明らかになった。Daam1とALOX12の細胞内共局在を明らかにするとともに、RhoA下流阻害剤( Y-27632) を内因性のALOX12が発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の産生が抑制されるかどうかをELISAで検討中である。また各種RhoファミリーノックアウトマウスにおけるALOX12の細胞内局在を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々はRho family GTPaseをbaitとしたアフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー（LC/MS-MS）実験系を確立し、活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。そのうちアラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoAに結合することを見いだした。RhoAとALOX12をCOS-1細胞内で発現したところ両者の直接の結合は認められなかった。一方でRhoAエフェクターDaam1とALOX12の結合がCOS-1細胞での発現実験で証明された。このことからALOX12はDaam1を介して活性型RhoAに結合することが判明した。さらにALOX12のLH2ドメインがDaam1のN末に結合することが明らかになった。以上の進捗に加え、更に我々はCdc42上流グアニン交換因子Zizimin2,3, RhoFのノックアウトマウスを作製済みである。これに加えて複数のRho family GTPasesの全身性、またはコンディショナルノックアウトマウスを計画中である。以上のことからおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）加齢マウスにおけるALOX12活性上昇の確認と、Rho family機能との関連の証明
２ヶ月齢の若年マウス、２２ヶ月齢の加齢マウスの間で血中のALOX12酵素活性を下流の脂質メディエーターのELISAで比較する。 さらに血管におけるALOX12免疫染色を行う。これらの実験により加齢に伴いALOX12活性は上昇するという仮説を検証する。加齢マウスにRho family 阻害剤を加えて、血管内皮におけるALOX12の細胞内局在の障害と、下流の脂質メディエーター活性低下を介して動脈硬化の抑制効果が見られるかどうかを検証する。
２）Rho family ノックアウトマウスにおける加齢に伴う血管および免疫応答性の脆弱化の評価
既に我々はCdc42上流グアニン交換因子Zizimin2,3, RhoFのノックアウトマウスを作製済みである。これに加えて複数のRho family GTPasesの全身性、またはコンディショナルノックアウトマウスを計画中である。これらのRho family ノックアウトマウスで野生型と比較してALOX12の細胞内局在が障害され、脂質メディエーター活性が低下するかどうか検証する。ノックアウトマウスではALOX12局在が障害されるために動脈硬化進展が緩徐であることが予想され、さらに免疫担当細胞の遊走能低下により免疫応答性の脆弱化が予想される。病理学的検討に加え、免疫応答の評価にはインフルエンザウイルス感染後の重篤性の指標としての生存曲線とBALF洗浄液中の好中球をはじめとする免疫細胞の変化、抗原刺激に対する応答性を同年齢の対照野生型マウスに比べて抗体、サイトカイン産生能等の低下が見られるか等を解析する。また既知のALOX12インヒビターを使用することにより、上記の表現型がより強調されるかどうかを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において、アフィニティークロマトグラフィーおよびシグナル伝達実験はすべて国立長寿医療研究センター研究所に設置されている機器および専門オペレーターによりデータを得ることができ、経費の削減ができたたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２９年度は国立長寿医療研究センター研究所において細胞生物学的実験、マウス実験のために予算執行をしていく。
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