ヒト造血細胞でのゲノム編集技術基盤の確立と血液腫瘍病態解析への応用

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K09478
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 松井 啓隆 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (60379849)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: DNAメチル化 / 造血器腫瘍 / エピゲノム

研究実績の概要

本研究は、ゲノム編集による造血器腫瘍発症モデルを確立することを目的とし、遺伝子変異／遺伝子欠損の造血器腫瘍への関与を、ヒト造血細胞を用いて、より直接的に解明することをめざすものである。
これまで、造血器悪性腫瘍の解析には、白血病細胞株や初代培養造血細胞、マウスモデルが有用なツールとして汎用されてきた。しかしながら、細胞への変異遺伝子導入やマウス骨髄移植は、多くの場合、内在的な発現レベルを大きく超えた過剰発現系での解析となってしまうという問題点がある。また、腫瘍抑制因子の欠損を再現する場合に頻用されるノックダウン手法も、必ずしも発現レベルの調節が容易ではない。このため、遺伝子変異導入や発現抑制により起こる細胞表現型の変化を疾患と対比させて考える場合には、十分な注意が必要である。ノックアウトマウスモデルはこれを回避できる優れた実験系と言えるが、マウスモデルの作製には多くの専門的技術を要し、コストも無視できない。
こうしたことを背景に、本研究では造血細胞に対するゲノム編集手法の確立を進めることとした。最適なベクターの構築を図るため、現在、白血病細胞株を用いた基礎検討を進めている。当初、レトロ・レンチウイルスによるベクター導入を実施してきたが、少なくとも細胞株においてはNucleofectorが最も簡便かつ効率的に遺伝子導入できることが判明したため、本装置を用いた実験系を構築している。一方、ゲノム編集の対象とする遺伝子は、DDX41遺伝子を主なターゲットに据えている。本遺伝子の場合、生殖細胞系列変異としては主にフレームシフトが起こり、機能喪失型の変異に至る。一方、体細胞遺伝子変異はほぼp.R525Hに集中していることから、機能獲得型変異である可能性が高い。今後、このふたつの変異を組み合わせたコンパウンドヘテロ細胞の作成と表現型解析を進め、実験手法開発を基軸とした病態解明をめざす。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究申請後に所属大学の異動が生じ、新たに研究室を立ち上げることとなったため、スタート時期にやや遅れが生じたのは否めない。しかしながら、その後研究室の整備も進み、各種の実験が再開可能な状態になったため、2年目にはほぼ所期のペースで研究が進んでいる。最終年度には修士課程学生の入学が見込まれるので、さらにペースアップが期待できる。
なお、研究開始当初はゲノム編集によるモノソミー7モデルの作成を計画していたが、2016年に我々が論文発表したDDX41遺伝子変異が、導入の容易さや病態解析の点でより適したターゲットと考えるようになり、現在は主な対象をこちらにシフトさせている。
次年度は、さらにベクター及び遺伝子導入手法の最適化を図り、より高効率のシステム構築を進めるとともに、より導入困難な初代培養細胞でのゲノム編集を視野に入れる。

今後の研究の推進方策

最終年度は、白血病細胞株をモデルとしたDDX41遺伝子のゲノム編集を確立し、当該遺伝子のノックアウトやノックインに伴う細胞表現型の解析に進む。DDX41遺伝子の体細胞変異(p.R525H)を血液細胞に導入すると、ある種のリボソームストレスが惹起され、細胞増殖の抑制が生じる。しかしながら、当該遺伝子変異のみをマウス骨髄移植(強制発現系)で導入しても白血病の発症には至らなかったことから、同遺伝子の生殖細胞系列変異(p.D140fsなど機能欠失型変異)との協調、もしくは他の遺伝子の体細胞変異との協調が必要であると考えられる。これを証明するため、DDX41遺伝子のノックアウトとp.R525H強制発現の両者を導入した細胞を作成し、細胞増殖や造腫瘍性などの表現型、および網羅的なエピゲノム変化などの分子生物学的解析を実施する。また、これに加えて初代培養造血細胞を用いたゲノム編集技術の確立にも挑みつづける。ゲノム編集の効率が低いこと、またゲノム編集後クローンの選択が難しいことなどが障壁となるが、ゲノム編集後の細胞をバルクで移植する実験を用い、クローン優位性などを検証することで研究遂行可能であると見込んでいる。

次年度使用額が生じた理由

今年度は経費の節約ができたため未使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

次年度、試薬の購入に充てたい。

研究成果

• [雑誌論文] A case of pulmonary thromboembolism due to coagulation factor V Leiden in Japan ~Usefulness of next generation sequencing~. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sueta D, Ito M, Uchiba M, Sakamoto K, Yamamoto E, Izumiya Y, Kojima S, Kaikita K, Shinriki S, Hokimoto S, Matsui H, Tsujita K.
  • 雑誌名: Thromb. J. 巻: 15(8) ページ: -
  • DOI: 10.1186/s12959-017-0132-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cooperative gene activation by AF4 and DOT1L drives MLL-rearranged leukemia. (2017)
  • 著者名/発表者名: Okuda H, Stanojevic B, Kanai A, Kawamura T, Takahashi S, Matsui H, Takaori-Kondo A, Yokoyama A.
  • 雑誌名: J. Clin. Invest. 巻: 127(5) ページ: 1918-1931
  • DOI: 10.1172/JCI91406
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sugino N, Kawahara M, Tatsumi G, Kanai A, Matsui H, Yamamoto R, Nagai Y, Fujii S, Shimazu Y, Hishizawa M, Inaba T, Andoh A, Suzuki T, Takaori-Kondo A.
  • 雑誌名: Leukemia. 巻: 31(11) ページ: 2303-2314
  • DOI: 10.1038/leu.2017.59
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of combinatorial dysfunctions of Tet2 and Ezh2 on the epigenome in the pathogenesis of myelodysplastic syndrome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa N, Oshima M, Sashida G, Matsui H, Koide S, Saraya A, Wang C, Muto T, Takane K, Kaneda A, Shimoda K, Nakaseko C, Yokote K, Iwama A.
  • 雑誌名: Leukemia. 巻: 31(4) ページ: 861-871
  • DOI: 10.1038/leu.2016.268
  • 査読あり
• [雑誌論文] Propagation of tri-methylated H3K27 regulated by EED is required for embryogenesis, hematopoietic maintenance, and tumor suppression. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ueda T, Nakata Y, Nagamachi A, Yamasaki N, Kanai A, Matsui H, Honda ZI, Oda H, Wolff L, Inaba T, Honda H.
  • 雑誌名: PNAS 巻: 113(37) ページ: 10370-10375
  • DOI: 10.1073/pnas.1600070113
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hereditary amyloidosis with cardiomyopathy caused by the novel variant transthyretin A36D. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamashita T, Ueda M, Saga N, Nanto K, Tasaki M, Masuda T, Misumi Y, Oda S, Fujimoto A, Amano T, Takamatsu K, Yamashita S, Obayashi K, Matsui H, Ando Y.
  • 雑誌名: Amyloid 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1080/13506129.2016.1202228
  • 査読あり
• [雑誌論文] A new variant of acute promyelocytic leukemia with IRF2BP2-RARA fusion. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimomura Y, Mitsui H, Yamashita Y, Kamae T, Kanai A, Matsui H, Ishibashi T, Tanimura A, Shibayama H, Oritani K, Kuyama J, Kanakura Y.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 107(8) ページ: 1165-1168
  • DOI: 10.1111/cas.12970
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biological implication of somatic DDX41 p.R525H mutation in acute myeloid leukemia. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kadono M, Kanai A, Nagamachi A, Shinriki S, Kawata J, Iwato K, Kyo T, Oshima K, Yokoyama A, Kawamura T, Nagase R, Inoue D, Kitamura T, Inaba T, Ichinohe T, Matsui H.
  • 雑誌名: Exp. Hematol. 巻: 44(8) ページ: 745-754
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2016.04.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Setdb1 maintains hematopoietic stem and progenitor cells by restricting the ectopic activation of non-hematopoietic genes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Koide S, Oshima M, Takubo K, Yamazaki S, Nitta E, Saraya A, Aoyama K, Kato Y, Miyagi S, Nakajima-Takagi Y, Chiba T, Matsui H, Arai F, Suzuki Y, Kimura H, Nakauchi H, Suda T, Shinkai Y,Iwama A.
  • 雑誌名: Blood 巻: 128(5) ページ: 638-649
  • DOI: 10.1182/blood-2016-01-694810
  • 査読あり
• [学会発表] ヒト遺伝子検査の現状と展望 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松井啓隆
  • 学会等名: 日本臨床化学会 第56回年次学術集会
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-03
  • 招待講演
• [学会発表] 血中miRNA解析の標準化に関する基礎的検討 血漿と血清miRNA値の比較 (2016)
  • 著者名/発表者名: 塩津 弘倫, 岡田 和大, 白濱 早紀, 黒木 千恵理, 上田 沙央理, 池田 勝義, 松井 啓隆, 栢森 裕三, 梅村 創
  • 学会等名: 第63回臨床検査医学会学術集会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-09-01 – 2016-09-01
• [学会発表] CYLDは頭頸部扁平上皮癌におけるEGFR標的治療の感受性制御因子である (2016)
  • 著者名/発表者名: 神力 悟, 城野 博丈, 安東 由喜雄, 松井 啓隆
  • 学会等名: 第63回臨床検査医学会学術集会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-09-01 – 2016-09-01
• [学会発表] Impaired hematopoietic cell growth caused by the expression of p.R525H DDX41 mutation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsui H, Kanodo M, Kanai A, Nagamachi A, Inaba T.
  • 学会等名: 第45回ISEH(国際実験血液学会)年次総会
  • 発表場所: 米国 サンディエゴ
  • 年月日: 2016-08-26 – 2016-08-26
  • 国際学会
• [学会発表] Somatic DDX41 p.R525H mutation causes growth defect in hematopoietic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsui H, Nagamachi A, Kanai A, Inaba T
  • 学会等名: 第21回欧州血液学会年次総会
  • 発表場所: デンマーク コペンハーゲン
  • 年月日: 2016-06-11 – 2016-06-11
  • 国際学会
• [図書] 造血器腫瘍アトラス 改訂第5版 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松井啓隆, 稲葉俊哉
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 日本医事新報社