研究課題
1.PD-L1に対するchimeric signaling receptor (PD-L1-CSR)の開発および機能解析:PD-L1に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとに単鎖抗体可変領域をデザインし、細胞内ドメインとしてCD28/41BB/その両方をもつ分子を作成した。これらをレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、抗原ときちんと結合することが分かった。In vitro/in vivoにおける効果を今後検討していく。2．CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発T リンパ球においてCTLA-4 をKO するため、当初レンチウイルスベースのシステムの開発を試みたが、遺伝子導入時の細胞傷害性が強く発現しうまくいかなかった。そこでCas9 protein systemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。現在CTLA-4 KO が可能であることを示すため、Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討している。作成されたCTLA-4 KO/CD19CAR-T リンパ球あるいはCTLA-4 KO/TCR 遺伝子導入T リンパ球を用いて、in vitro およびin vivo においてこれら細胞のCTLA-4 KO の効果を今後検討する。
2: おおむね順調に進展している
1.PD-L1-CSRの開発および機能解析目的とする分子の作成は可能であった。今後CSRの機能解析を行うためには、TCRあるいはCARと共発現させたうえで、細胞刺激を行い、その上でシグナルを検討する必要がある。そのため現在CARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系を作成している。2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発CTLA-4 KOはCas9 protein systemを用いて行うことによって可能であった。現在遺伝子KOの効率を検討している。遺伝子導入効率としては、CTLA-4発現のフローサイトメトリーによる検討の他に、遺伝子の切断を分子学的に検討する。
1.PD-L1-CSRの開発および機能解析CARとの共発現の系で検討を進める予定としているが、CAR→CSRの順に遺伝子導入し、効率よく純化するために、これまで用いてきたEGFRの遺伝子マーカーに加えて、もう一種類CD20を遺伝子マーカーとして用意するために準備を進めている。CD20とEGFRの2つの遺伝子導入マーカーを用いて順に純化することによって、高い効率でCAR/CSRの両方が遺伝子導入された細胞を得ることが出来る。あるいはどれだけ遺伝子導入されているか明らかになった細胞で実験を進めることが出来る。標的細胞としてもともとPD-L1陰性の細胞株にPD-L1を遺伝子導入して準備する。これを用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発現在行っている実験において遺伝子KO効率が十分高いことが分かれば、その上でそれらの細胞を用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。具体的には繰り返し刺激後の反応の減弱の有無について検討する。
PD-L1-CSRの遺伝子導入に加えて、T細胞レセプター（TCR）あるいはキメラ抗原レセプターとの併用において、シグナルを検討する予定としていたが、TCRの遺伝子導入がなかなか進捗しなかったことから、以降の実験に用いるために予定していた抗体や関連の試薬費用が次年度へと持ち越しとなった。
キメラ抗原レセプター遺伝子の遺伝子導入との組み合わせにおいてPD-L1-CSRを検討することにしたため、遺伝子導入効率や遺伝子導入の効果について以降の実験で検討するため予定していた抗体や関連の試薬費用として使用する予定である。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 3件) 産業財産権 (1件)
Biol Blood Marrow Transplant.
巻: 22 ページ: 330-338
10.1016/j.bbmt.2015.10.006.
Bone Marrow Transplant.
巻: 50 ページ: 1187-1194
10.1038/bmt.2015.119.
巻: 50 ページ: 1135-1137
10.1038/bmt.2015.114.
Ann Hematol.
巻: 94 ページ: 1139-1148
10.1007/s00277-015-2312-4.
