免疫抑制的腫瘍微小環境を打破する遺伝子導入Tリンパ球の開発とその機能解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K09497
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 寺倉 精太郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (40625141)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: キメラ抗原レセプター / 遺伝子導入T細胞療法 / CD8陽性 / Tリンパ球 / 腫瘍微小環境

研究実績の概要

1.PD-L1に対するchimeric signaling receptor (PD-L1-CSR)の開発および機能解析
PD-L1に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとに単鎖抗体可変領域をデザインし、細胞内ドメインとしてCD28/4-1BB/その両方をもつ分子を作成した。これらをレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、PD-L1ときちんと結合することが分かった。PD-L1 chimeric antigen receptor を作成し、Tリンパ球に遺伝子導入し、PD-L1を発現する標的細胞に対する細胞傷害活性を確認したところ、良好な細胞傷害活性が確認出来た。その後、CD19CAR-Tをモデルとして用いて、PD-L1-CSRを遺伝子導入し、in vitroにおける効果の検討を試みたが、二つの分子を遺伝子導入することがなかなか出来なかった。現在、単一のウイルスベクターによって二つの遺伝子が導入可能なように工夫したウイルスベクターを作成中である。
2．CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
ヒト・プライマリー・T リンパ球においてCTLA-4 をKO するため、Cas9 protein systemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討したところ、CTLA-4発現は低下していることが確認出来た。CTLA-4 KO/CD19CART リンパ球を作成するため、細胞作成の手順を検証している。CD19CARとCTLA-4 KOをどのタイミングで行うのが最も効率が良いのかについて検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

1.PD-L1-CSRの開発および機能解析
CSRの機能解析を行うためにCARと共発現させたうえで、細胞刺激を行い、その上でシグナルを検討する必要がある。そのためCARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系の作成を試みたが、2回の遺伝子導入を行うことは困難であった。そのため現在一回の遺伝子導入で両方を遺伝子導入出来る系を確立しようとしている。

2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
CTLA-4 KOはCas9 protein systemを用いて行うことによって可能であった。CTLA-4 KO/CD19CART リンパ球を作成するため、細胞作成の手順を検証している。

今後の研究の推進方策

1.PD-L1-CSRの開発および機能解析
CARとの共発現の系で検討を進める予定としている。CARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系の作成を試みたが、2回の遺伝子導入を行うことは困難であった。そのため現在一回の遺伝子導入で両方を遺伝子導入出来る系を確立しようとしている。標的細胞としてもともとPrimary Mediastinal Large B-cell リンパ腫の細胞株が恒常的にPD-L1を発現し手いると報告されているため、これを入手してin vitro/ in vivoの実験を進める。

2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
現在行っている実験において細胞調製の手順が決定されれば、その上でそれらの細胞を用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。具体的には繰り返し刺激後の反応の減弱の有無について検討する。

次年度使用額が生じた理由

概ね予定通りの支出となったが、一部時期的に間に合わないものがあったため次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

最終年度の予定額に合算して支出する予定としている。

研究成果

• [雑誌論文] Exploratory research for optimal GvHD prophylaxis after single unit CBT in adults: short-term methotrexate reduced the incidence of severe GvHD more than mycophenolate mofetil. (2017)
  • 著者名/発表者名: Terakura S, Wake A, Inamoto Y, Murata M, Sakai R, Yamaguchi T, Takahashi S, Uchida N, Onishi Y, Ohashi K, Ozawa Y, Kanamori H, Yamaguchi H, Fukuda T, Ichinohe T, Takanashi M, Atsuta Y, Teshima T.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant. 巻: 52(3) ページ: 423-430
  • DOI: 10.1038/bmt.2016.255.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of T-cell chimerism on relapse after cord blood transplantation for hematological malignancies: Nagoya Blood and Marrow Transplantation Group study (2017)
  • 著者名/発表者名: Yokohata E, Kuwatsuka Y, Ohashi H, Terakura S, Kawashima N, Seto A, Kurahashi S, Ozawa Y, Goto T, Imahashi N, Nishida T, Miyao K, Sakemura R, Kato T, Sawa M, Kohno A, Sao H, Iida H, Kiyoi H, Naoe T, Miyamura K, Murata M.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant. 巻: 52(4) ページ: 612-614
  • DOI: 10.1038/bmt.2016.323.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increase of bone marrow macrophages and CD8(+) T lymphocytes predict graft failure after allogeneic bone marrow or cord blood transplantation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kawashima N, Terakura S, Nishiwaki S, Koyama D, Ozawa Y, Ito M, Miyamura K.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant. 巻: 52(8) ページ: 1164-1170
  • DOI: 10.1038/bmt.2017.58.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of graft-versus-host disease on outcomes after unrelated cord blood transplantation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kanda J, Morishima Y, Terakura S, Wake A, Uchida N, Takahashi S, Ono Y, Onishi Y, Kanamori H, Aotsuka N, Ozawa Y, Ogawa H, Sakura T, Ohashi K, Ichinohe T, Kato K, Atsuta Y, Teshima T, Murata M.
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 31(3) ページ: 663-668
  • DOI: doi: 10.1038/leu.2016.288.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Malignant lymphoma with cardiac involvement. (2017)
  • 著者名/発表者名: Terakura S, Onji M, Iriyama C, Goto T, Ushijima Y, Shimada K, Ishikawa Y, Nishida T, Hayakawa F, Murata M, Kiyoi H.
  • 雑誌名: Rinsho Ketsueki. 巻: 58(3) ページ: 239-242
  • DOI: doi: 10.11406/rinketsu.58.239.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Programmed Death-Ligand 1 on Antigen-presenting Cells Facilitates the Induction of Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocytes: Application to Adoptive T-Cell Immunotherapy. (2016)
  • 著者名/発表者名: Goto T, Nishida T, Takagi E, Miyao K, Koyama D, Sakemura R, Hanajiri R, Watanabe K, Imahashi N, Terakura S, Murata M, Kiyoi H.
  • 雑誌名: J Immunother. 巻: 39(8) ページ: 306-315
  • DOI: doi: 10.1097/CJI.0000000000000136.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Tet-On Inducible System for Controlling CD19-Chimeric Antigen Receptor Expression upon Drug Administration. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sakemura R, Terakura S, Watanabe K, Julamanee J, Takagi E, Miyao K, Koyama D, Goto T, Hanajiri R, Nishida T, Murata M, Kiyoi H.
  • 雑誌名: Cancer Immunol Res. 巻: 4(8) ページ: 658-668
  • DOI: doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-0043.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] ステロイド抵抗性急性GVHDに対するヒト骨髄由来間葉系幹細胞治療：単一施設における後方視的検討. (2017)
  • 著者名/発表者名: 村田誠、松下正、後藤辰徳、入山智沙子、寺倉精太郎、西田徹也、清井仁
  • 学会等名: 第16回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • 年月日: 2017-03-07 – 2017-03-09
• [学会発表] ヒトGVHD組織におけるアロ反応性T細胞の解析. (2017)
  • 著者名/発表者名: 小山大輔、村田 誠、奥野真吾、鴨下園子、Jakrawadee Julamanee、高木えり奈、宮尾康太郎、後藤辰徳、酒村玲央奈、葉名尻 良、寺倉精太郎、西田徹也、清井仁.
  • 学会等名: 第39回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: くにびきメッセ・島根県民会館（島根県松江市）
  • 年月日: 2017-03-02 – 2017-03-04
• [学会発表] 当院におけるステロイド治療抵抗性急性GVHDに対するヒト間葉系幹細胞治療の後方視的検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 後藤辰徳、入山智沙子、寺倉精太郎、西田徹也、村田 誠、清井仁
  • 学会等名: 第39回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: くにびきメッセ・島根県民会館（島根県松江市）
  • 年月日: 2017-03-02 – 2017-03-04
• [学会発表] Improvement of antigen-specific CTL persistence by transduction of novel artificial adopter molecule (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮尾康太郎、寺倉精太郎、渡邉慶介、酒村玲央奈、Jakrawadee Julamanee、奥野真吾、鴨下園子、高木えり奈、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • 学会等名: 58th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: San Diego （USA）
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] Intrabone transplantation of a single cord blood unit using non-irradiated reduced-intensity conditioning. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murata M, Maeda Y, Masuko M, Onishi Y, Endo T, Terakura S, Ishikawa Y, Iriyama C, Ushijima Y, Goto T, Fujii N, Tanimoto M, Kobayashi H, Shibasaki Y, Fukuhara N, Inamoto Y, Suzuki R, Matsushita T, Kodera Y, Kiyoi H, Naoe T, Nishida T.
  • 学会等名: 58th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: San Diego （USA）
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] Phase 1 clinical trial of adoptive immunotherapy for acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome, using gene-modified autologous lymphocytes expressing WT1-specific T-cell receptor. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tanimoto K, Fujiwara H, Tawara I, Masuya M, Kageyama S, Nishida T, Murata M, Terakura S, Akatsuka Y, Ikeda H, Miyahara Y, Nukaya I, Takesako K, Emi N, Katayama N, Shiku H, Yasukawa M.
  • 学会等名: 58th ASH Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: San Diego （USA）
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] 心臓浸潤を認めた悪性リンパ腫3例の経験 (2016)
  • 著者名/発表者名: 陰地真晃、入山智沙子、寺倉精太郎、島田和之、石川裕一、西田徹也、早川文彦、村田誠、清井仁
  • 学会等名: 第230回日本内科学会東海地方会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2016-10-16
• [学会発表] Rare deletion mutation in PML-RARA and its biological significance in APL (2016)
  • 著者名/発表者名: 服部 光、 石川裕一、 宮尾康太郎、平野大希、寺倉精太郎、西田徹也、村田 誠、清井 仁
  • 学会等名: 第78回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-13 – 2016-10-15
• [学会発表] Gene modification by adapter molecule improves the expansion of antigen-specific CTL (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮尾康太郎、寺倉精太郎、渡邊慶介、高木えり奈、Jakrawadee Julamanee, 小山大輔、酒村玲央奈、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • 学会等名: 第78回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-13 – 2016-10-15
• [学会発表] REG3A polymorphism is associated with the incidence of extensive chronic GVHD after allogeneic BMT (2016)
  • 著者名/発表者名: 小山大輔、村田誠 Jakrawadee Julamanee、高木えり奈、宮尾康太郎、酒村玲央奈、後藤辰徳、葉名尻良、瀬戸愛花、小澤幸泰、宮村耕一、寺倉精太郎、西田徹也、清井仁
  • 学会等名: 第78回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-13 – 2016-10-15
• [学会発表] Adoptive transfer of WT1-specific TCR-gene-transduced T lymphocytes in patients with hematological malignancies. (2016)
  • 著者名/発表者名: 俵功、藤原弘、村田誠、赤塚美樹、西田徹也、寺倉精太郎、恵美宣彦、桝屋正浩、池田裕明、片山直之、安川正貴、影山慎一、珠玖 洋.
  • 学会等名: 第75回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [学会発表] ヒトGVHD組織におけるアロ反応性T細胞の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小山大輔、村田 誠、奥野真吾、鴨下園子、Jakrawadee Julamanee、高木えり奈、宮尾康太郎、後藤辰徳、酒村玲央奈、葉名尻 良、寺倉精太郎、西田徹也、清井 仁.
  • 学会等名: 第8回血液疾患免疫療法学会学術集会
  • 発表場所: 北海道大学医学部学友会館「フラテ」(北海道札幌市）
  • 年月日: 2016-09-03
• [学会発表] 人工アダプター分子の遺伝子導入による抗原特異的CTL療法の改良 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮尾康太郎、寺倉精太郎、渡邊慶介、酒村玲央奈、奥野真吾、鴨下園子、高木えり奈、Jakrawadee Julamanee、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻 良、西田徹也、村田 誠、清井 仁.
  • 学会等名: 第8回血液疾患免疫療法学会学術集会
  • 発表場所: 北海道大学医学部学友会館「フラテ」(北海道札幌市）
  • 年月日: 2016-09-03
• [学会発表] A new strategy to control CD19 CAR; regulation under tetracycline-inducible system allows on-demand CD19 CAR expression and disappearance. (2016)
  • 著者名/発表者名: 酒村玲央奈、寺倉精太郎、Jakrawadee Julamanee、宮尾康太郎、西田徹也、村田 誠、清井 仁.
  • 学会等名: 第7回日本血液学会国際シンポジウム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • 年月日: 2016-05-13 – 2016-05-14
• [学会発表] ATO不耐容かつATRA耐性変異を獲得し再燃した二次性前骨髄球性白血病の一例 (2016)
  • 著者名/発表者名: 宮尾康太郎、平野大希、服部光、西山誉大、石川裕一、寺倉精太郎、西田徹也、村田誠、清井仁
  • 学会等名: 第５回日本血液学会東海地方会
  • 発表場所: ウインク愛知（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2016-04-23
• [学会発表] A new strategy to control CD19 CAR expression; regulation under tetracycline-inducible system allows on-demand CD19 CAR expression and disappearance (2016)
  • 著者名/発表者名: 酒村玲央奈、寺倉精太郎、渡邊慶介、Jakrawadee Julamanee 、 高木えり奈、宮尾康太郎、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • 学会等名: 42nd Annual Meeting of the European Society for Blood and Marrow Transplantation
  • 発表場所: バレンシア（スペイン）
  • 年月日: 2016-04-06 – 2016-04-06
  • 国際学会
• [産業財産権] Ｔ細胞機能向上のためのアダプター分子 (2016)
  • 発明者名: 寺倉精太郎、清井仁、宮尾康太郎
  • 権利者名: 名古屋大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2016-122958
  • 出願年月日: 2016-06-21
  • 外国