| 研究課題/領域番号 |
15K09500
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉本 直志 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (10447956)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | DHX29 / 血液細胞 / 造血器腫瘍 / 核酸センシング / 自然免疫 / 造腫瘍性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヒト血液細胞の自然免疫反応ならびに造血器腫瘍におけるDHX29分子の役割を明らかにすることを目的としている。平成27年度からの結果に加え、平成27年度でも、引き続き正常血液細胞におけるDHX29分子の発現を調べた結果、末梢血由来の単球やB細胞、CD4+T細胞・CD8+T細胞、NK細胞では、新鮮単離状態では発現が低かったものの、分化させた単球、活性化させたB細胞およびT細胞に発現上昇を認めたが、 興味深いことにNK細胞では見られなかった。このことから、DHX29は、分化や活性化した細胞では一般的に機能している可能性が示唆されたが、NK細胞については更に検証が必要である。
他方、造血器腫瘍細胞株では、THP-1細胞とその分化させた状態を始め、多くの細胞株について強い発現が認められた。そこで、DHX29に対するノックダウンを、shRNAの系を用いて検討した。準備したshRNAの5クローンのうち、2-3クローンは複数の細胞株において良好なノックダウン効果を示した。機能的には、いくつかの細胞株で増殖が低下して来ることが観察された。
合わせて考えると、DHX29は、血液系細胞において分化・増殖に重要な役割を果たす分子であることが示唆される。正常細胞でのノックダウンも進行中で、臨床検体の解析の準備も進んでおり、DHX29が腫瘍により強く影響を及ぼすのかどうかは、重要な知見が得られると期待される。
また、昨年には他の複数のグループより、同じDExD/Hヘリカーゼ・ファミリー分子であるDDX41の変異が、家族性および散発性の骨髄異形成症候群/急性白血病に多く見られることが報告されており、DDX41とDHX29のそれぞれの機能を同一の細胞で比較することもすすめており、その協調性、相補性の有無などの検討が可能となる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H28年度においては、H27年度に得られた発現パターンのさらなる充実に加え、血液細胞や造血器腫瘍におけるDHX29分子の機能を調べることを主眼とした。その結果、末梢血の細胞分画の新鮮単離状態および分化後や活性化後のサンプルも網羅された。昨日解析においては、shRNAシステムを立ち上げて、薬剤誘導性にノックダウンすることに成功した。その結果、機能解析のデータとして増殖および免疫反応に関するデータが蓄積されつつある。
組織由来の血液・免疫細胞および造血器腫瘍の臨床検体については、研究代表者の異動があったことから遅れていたが、同意説明書の準備やサンプル入手ルートが整備されつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
H28年度の、造血器腫瘍株および正常血液細胞の発現解析とノックダウンの成果を踏まえ、機能解析を進めていく。増殖については、短期増殖や長期増殖の観察を進めていく。腫瘍細胞株の免疫応答については、単球株はTLRリガンド、細胞内核酸受容体リガンドによる成熟やサイトカイン産生を検証する。リンパ球株では、B細胞レセプターおよびT細胞レセプター刺激によるサイトカイン応答を検証する。
正常末梢血細胞分画についても、可能な限りノックダウンを行い、検証を進める。特にT細胞は ｓｈRNAシステムでも操作可能であり、ノックダウンによる増殖とサイトカイン産生の影響について検証をすすめる。単球については、ややノックダウン効率は下がると見込まれるが、可能な限り検証を進める。
以上の結果から、有意な差が見られた株についてメカニズムを検証する予定である。具体的には、タンパク免疫沈降による候補分子の検証、コンフォーカル顕微鏡による機能と局在の検証、ウェスタンブロットによる免疫応答シグナリングや増殖関連分子の発現・活性化を検証する。
臨床検体についても、入手の体制が整い次第、発現の解析、変異の有無の検証を行う。
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