CTLA-4-Igの新たな作用を解析し次世代の治療標的の探索に繋げる基盤研究

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K09531
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 川上 純 長崎大学, 医歯薬総合研究科(医学系), 教授 (90325639)
• 研究分担者: 岩本 直樹 長崎大学, 医歯薬総合研究科(医学系), 助教 (80437897) ; 一瀬 邦弘 長崎大学, 医歯薬総合研究科(医学系), 講師 (60437895) ; 古賀 智裕 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (90537284) ; 右田 清志 独立行政法人国立病院機構(長崎医療センター臨床研究センター), 臨床研究センター, 病因解析研究部長 (60264214) ; 中村 英樹 長崎大学, 病院(医学系), 講師 (10437832) ; 佐々木 均 長崎大学, 病院(医学系), 教授 (00170689)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 関節リウマチ / CTLA-4Ig / リバースシグナル / 単球 / 破骨細胞 / アレイ解析 / 関節超音波

研究実績の概要

CTLA-4Igが惹起するリバースシグナルに関して、平成27年度は、磁気ビーズで単離したヒト末梢血CD14陽性単球を用いて検討した。ヒトCD14陽性単球から破骨細胞を安定的に分化誘導する系を確立した。それに種々の濃度のCTLA-4Igを添加し、M-CSF＋RANKLで誘導される破骨細胞を、再現性をもって抑制するCTLA-4-Ig濃度を特定した。すなわち、この実験条件においては、CTLA-4Igは、形態的ならびに機能的に破骨細胞誘導系を抑制し、CTLA-4Igはリバースシグナルを惹起すると考えられる。一方、九州地区多施設共同前向きRA超音波コホート研究であるが、総エントリーは200症例以上で、12ヶ月以上フォローアップされている群も100症例以上となり、CTLA-4Ig（アバタセプト）群も40症例を超えている。グループ効果としてDAS28、SDAI、CDAIの評価指数は有意に低下、かつ、滑膜肥厚（グレースケール：GS）と滑膜血流シグナル（パワードプラ：PD）も有意に低下し、有効性に応じた群間比較も可能となりつつあるが、これら症例の血液サンプルも集積されている。PreliminaryにBio-plex Pro™ Human Cytokine assay、Milliplex® MAP Human Cytokine/Chemokine panel 1を用いて血清の45分子のサイトカイン、ケモカイン、成長因子を測定中であるが、いくつかの分子においては、アバタセプトにより、有意な発現変動が認められている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成27年度の大きな目標は、In vitroの細胞培養系を用い、CTLA-4Igの作用を、RAの病態形成に重要な細胞群の分化・サイトカイン産生・アポトーシス感受性の観点から解析することである。そこでSchett教授が報告したCTLA-4Igの検証およびそのシグナル伝達から研究を開始した。磁気ビーズで単離したヒト末梢血CD14陽性単球を用いたが、既報とはM-CSF、RANKL、CTLA-4Igなどの培養条件は異なるが、M-CSF＋RANKLで、安定的に破骨細胞を分化誘導できる系を確立した。CTLA-4Igも、これも既報とは濃度条件などが異なるが、M-CSF＋RANKLで誘導される破骨細胞形成を抑制した。現在、マイクロアレイでの遺伝子発現変動を解析中で、Key moleculesの特定を目指している。ヒト末梢血CD14陽性単球以外のlineage解析も準備段階に入った。これに並行する形で、九州地区多施設共同前向きRA超音波コホート研究からの血清検体のアレイ解析を実施し、CTLA-4Ig治療経過で、いくつかの有意に発現が変動する分子を見出した。今回用いたアレイキットに加え、より網羅的に分子の発現変動が評価できるアレイキットでの評価を検討中で、このIn vivoで抽出された分子と、前述のIn vitroで抽出された分子を比較検討することにより、ターゲットの絞り込みが可能となる。以上より、研究はおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

平成28年度は平成27年度の解析を継続し、CTLA-4-Igが惹起するリバースシグナルにおけるKey moleculesの抽出を目指す。平成27年度においては、磁気ビーズで単離した末梢血CD14陽性単球を用い、M-CSF＋RANKLで誘導される破骨細胞培養系をCTLA-4-Igは有意に抑制した。現在、マイクロアレイでKey moleculesを同定中であるが、この成果を他のヒト培養細胞系にも展開し、RAの病態形成に重要な細胞群の分化・サイトカイン産生・アポトーシス感受性の観点から、リバースシグナルの解析を継続する。また、これらIn vitroのデータの検証を、活動性RAに対してCTLA-4Ig（アバタセプト）が継続的に投与された症例（九州地区多施設共同前向きRA超音波コホート研究）の血液検体を用いて行うが、平成27年度のPreliminaryな解析で、炎症や自己免疫に関連する分子の発現変動が示唆されている。そこでこれに関しても発展させるが、In vitroのデータと臨床検体（In vivo、活動性RA、九州地区多施設共同前向きRA超音波コホート研究）結果が合致すれば、その分子はCTLA-4-Igシグナルから明らかとなったRAの治療標的分子となる。マクロファージや破骨細胞の機能に関連する分子が抽出された場合は、骨粗鬆症の病態にも関与する可能性があり、骨粗鬆症の臨床研究への展開を計画する。また、動物モデル（コラーゲン誘発関節炎）でRA治療標的候補分子の有用性を実証する。すなわち、治療標的候補分子の組織や細胞での発現分布の確認と候補遺伝子ノックダウンによる関節炎治療効果を評価する。骨粗鬆症への応用可能と判断された場合は、骨粗鬆症モデル動物（卵巣摘出マウス）で、同様に解析する。

次年度使用額が生じた理由

当初の計画より試薬類が少なくても実験が遂行できたため。

次年度使用額の使用計画

今後も複数の実験計画があり、それに用いる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Magnetic Resonance Imaging Bone Edema at Enrollment Predicts Rapid Radiographic Progression in Patients with Early RA: Results from the Nagasaki University Early Arthritis Cohort. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakashima Y, Tamai M, Kita J, Michitsuji T, Shimizu T, Fukui S, Umeda M, Nishino A, Suzuki T, Horai Y, Okada A, Nishimura T, Koga T, Kawashiri SY, Iwamoto N, Ichinose K, Hirai Y, Arima K, Yamasaki S, Nakamura H, Origuchi T, Takao S, Uetani M, Aoyagi K, Eguchi K, Kawakami A.
  • 雑誌名: Journal of Rheumatology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.3899/jrheum.150988
  • 査読あり
• [雑誌論文] Upregulation of Thrombospondin 1 Expression in Synovial Tissues and Plasma of Rheumatoid Arthritis: Role of Transforming Growth Factor-beta1 toward Fibroblast-like Synovial Cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, Iwamoto N, Yamasaki S, Nishino A, Nakashima Y, Horai Y, Kawashiri S, Y Ichinose K, Arima K, Tamai M, Nakamura H, Origuchi T, Miyamoto C, Osaki M, Ohyama K, Kuroda N, Kawakami A.
  • 雑誌名: Journal of Rheumatology 巻: 42 ページ: 943-947
  • DOI: 10.3899/jrheum.141292
  • 査読あり
• [学会発表] MRI Bone Oedema at Enrollment Predicts the Development of Rapid Radiographic Progression at 1 year Toward Patients with Early-Stage Rheimatoid Arthritis: Results from Nagasaki University Arthritis Cohort. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakashima Y,Tamai M, Michitsuji T, Shimizu T, Fukui S, Umeda M, Nishino A, Koga T, Kawashiri S, Iwamoto N, Ichinose K, Hirai Y, Nakamura H, Origuchi T, and Kawakami A.
  • 学会等名: ACR 2015
  • 発表場所: San Francisco （USA）
  • 年月日: 2015-11-06 – 2015-11-11
  • 国際学会
• [学会発表] Ultrasound Evaluation of Efficacy of Biologic and Targeted Synthetic Dmards Toward Rheumatoid Arthritis Patients: Kyushu Multicenter Rheumatoid Arthritis Ultrasound Prospective Observational Cohort in Japan. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nishino A, Kawashiri S, Kawakami A, Yoshitama T, Eiraku N, Matsuoka N, Ueki Y, Okada A, Hamada H, Hidaka T, Nagano S, Tsuru T, Fujikawa K, and Arinobu Y.
  • 学会等名: ACR 2015
  • 発表場所: San Francisco （USA）
  • 年月日: 2015-11-06 – 2015-11-11
  • 国際学会
• [学会発表] 早期関節リウマチにおけるＭＲＩスコアとＸ線スコアの検討 (2015)
  • 著者名/発表者名: 玉井慎美，中島好一，上谷雅孝，川上 純
  • 学会等名: 第43回日本臨床免疫学会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県 神戸市）
  • 年月日: 2015-10-22 – 2015-10-24
• [学会発表] 関節超音波を用いた生物学的製剤の治療反応の評価：生物学的製剤のスイッチングの観点から (2015)
  • 著者名/発表者名: 西野文子，川尻真也，川上 純，吉玉珠美，榮樂信隆，松岡直樹，植木幸孝，岡田覚丈，都留智巳，日高利彦，濱田浩朗，藤川敬太，永野修司，有信洋二郎，田中良哉，井田弘明
  • 学会等名: 第50回九州リウマチ学会
  • 発表場所: 鹿児島県医師会館（鹿児島県 鹿児島市）
  • 年月日: 2015-09-05 – 2015-09-06
• [学会発表] 関節リウマチ患者におけるインドシアニングリーン増強蛍光光学画像検査の有用性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 川尻真也，西野文子，梅田雅孝，福井翔一，中島好一，鈴木貴久，古賀智裕，岩本直樹，一瀬邦弘，玉井慎美，中村英樹，折口智樹，青栁 潔，川上 純
  • 学会等名: 第50回九州リウマチ学会
  • 発表場所: 鹿児島県医師会館（鹿児島県 鹿児島市）
  • 年月日: 2015-09-05 – 2015-09-06