| 研究課題/領域番号 |
15K09603
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
石毛 美夏 日本大学, 医学部, 講師 (90420950)
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| 研究分担者 |
松本 太郎 日本大学, 医学部, 教授 (50366580)
谷ヶ崎 博 日本大学, 医学部, 准教授 (90378141)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 再生医療 / 間葉系幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
初年度は臍帯組織における間葉系幹細胞（MSC）および神経幹細胞の局在について、臍帯動脈周囲、臍帯静脈周囲、Wharton jellyの3部位において、特異的マーカーを用いて免疫組織学的検討を行い、MSCマーカー陽性細胞の多くは臍帯動脈内皮近傍およびWharton jellyに多く分布することを示した。臍帯動脈内皮直下には神経堤マーカーであるp75NTR陽性細胞が多数認められることを示し、臍帯動脈周囲組織由来の細胞は神経細胞の再生により高効率に利用できると考えられた。
2年目は、p75NTR陽性細胞およびMSCの免疫抑制に関する機能解析を行った。臍帯動脈から単離したp75NTR陽性細胞を含む細胞の中に神経細胞やグリア細胞に分化することができる神経幹細胞が存在することを示し、ライソソーム病の神経障害に対する細胞治療に応用可能と考えられた。また、臍帯、胎盤羊膜上皮および羊膜間質由来のすべてのMSCでリンパ球の増殖は抑制されたが、臍帯由来MSCが最も免疫抑制効果が高いことを示した。
今年度は、臍帯、胎盤羊膜上皮および羊膜間質由来のMSCにおける免疫制御能のさらなる検討を行った。通常の条件下もしくは炎症性サイトカインであるTNF-αおよびIFN-γ刺激下に、MSCおよびFibroblastを培養し、免疫抑制能にかかる因子の発現の変化を調べた。その結果、real time PCRまたは細胞表面抗原発現において、Fibroblastに比して臍帯、胎盤羊膜上皮および羊膜間質細胞由来のMSCは、PTGS2、HGF、HLA-E、IDO1、TGF-β1、TRAIL、PD-L1など様々な免疫抑制制因子の発現が上昇していた。それぞれの発現は個体差が大きかったが、臍帯由来MSCが免疫抑制因子の発現が強い傾向がみられた。以上より、胎盤MSCにおける免疫抑制効果は臍帯由来MSCが最も高いことが推測できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
臍帯全体の細胞でニューロスフェアアッセイを行う予定であったが、機能解析にはp75NTR陽性細胞のみでの検討が必要と判断し、臍帯からの回収細胞数を増やすべく努力した。しかし、p75NTR細胞由来のみでは機能解析まで行いうるニューロスフェアが得られず十分な解析が行えなかった。MSCの免疫原性に関する機能解析では、3種類のMSCの免疫抑制性因子の比較が可能なサイトカインの濃度や培養期間の検討に時間を有し、進行が遅れることとなった。
研究代表者の産前産後休暇取得および復職後の勤務時間短縮による実験の一時中止および進行の遅延があった。
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| 今後の研究の推進方策 |
臍帯p75NTR陽性細胞解析においては、採取後の臍帯の調整の改善および培養皿やサイトカインなどの基礎条件を再度検討し、採取細胞を増加するとともにごく少数の細胞からでも培養が可能条件をあらためて検討していく。
また、臍帯および羊膜由来MSC細胞の機能解析においては、免疫原性因子の発現条件に培養条件の検討に時間がかかることとなったが、適切な条件がほぼみつかっており、今後は現在の条件で例数を増やして検討をしていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分離および培養方法の条件について慎重に検討を行い、進行が予想より遅れることとなってしまった。そのため、細胞の機能解析が十分に行えず、その実験のために計上していた消耗品や動物の使用が少なくなった。
研究代表者の産前産後休暇取得および復職後の勤務時間短縮による実験の一時中止および進行の遅延があった。
次年度は改善した培養方法を用いることにより分離培養にかかる時間を減らし、培養効率をあげる、類似で細胞数が得られやすい他のMSCを用いるなどにより、実験の推進をはかり、細胞のin vitro、in vivo機能解析を行う。すなわち、臍帯、羊膜、骨髄からMSCを含む細胞の分離培養における条件を見直し、定常状態またはサイトカイン刺激下における各種因子の発現の変化をFACSなどを用いて蛋白レベルで調べ、免疫寛容誘導機能を検討し、差異があればその原因について詳細な検討を行う。臍帯からはp75NTR由来神経幹細胞を含む分画の細胞機能を検討する。これら細胞の造血幹細胞機能の維持、増殖、ホーミングに与える影響および神経細胞保護・再生機能について、各種因子の発現の変化やそれが与える影響を検討したうえで、これらの培養細胞のうち適切なものを用いて、生着不全モデルや疾患モデルを用いたin vivoでの細胞治療の条件設定を行う。これらのMSCに適切な細胞がなければ、新たな細胞ソースの使用についても検討する。
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