| 研究課題/領域番号 |
15K09629
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
藤本 崇宏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10446114)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ジストロフィン / 知的障害 / 分子機序 / 会合蛋白 / モデル細胞 |
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| 研究実績の概要 |
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）で発症する知的障害の病態機序解明と分子標的治療法の開発を目的として、初代神経細胞・神経幹細胞・株化細胞にてDp40発現改変や変異導入を施すことでモデル細胞を作製し、分子生物学的・細胞生物学的手法により脳神経系におけるDp40の分子機能および生物学的意義を明らかにすべく研究を開始した。
Dp40を哺乳類培養細胞系で安定発現させるためのベクターを構築し、それをHEK293T細胞に導入することで安定発現細胞を樹立した。タグ抗体によるウェスタンブロット解析と蛍光免疫細胞染色にて当該蛋白のサイズと細胞内局在が問題ないことを確認し、会合蛋白探索のための免疫沈降を行った。抽出条件・細胞数などの検討を経て、ある抽出条件依存的に会合を示す複数の分子を質量分析で同定するに至った。これらの蛋白分子に対する抗体が市販されていたので購入し、検証実験のための準備が完了した。
一方、自作のジストロフィンに対する抗体を使用して、マウス脳抽出物を材料に会合蛋白の探索も並行させた。その結果、シグナル関連分子が検出・同定され、これに関しても平成28年の検討課題として取り組む必要性が生じた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ベクター作製や安定発現細胞の樹立がスムーズに進み、このDp40発現改変モデル細胞を用いた会合蛋白探索において興味深い産物を同定するに至った。
また、自作ジストロフィン抗体を用いた解析において、マウス脳由来の会合蛋白も同定した。
よって計画通り次年度以降の検証実験やさらなるシグナル経路解析、そしてこれが関連する生物学的現象に関する研究へと繋げられるものと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
会合蛋白の候補群に関しては発現ベクター・抗体などを作製して検証実験を行う。
モデル細胞にて同定した物に関しては抽出条件依存的に会合の有無が変化するとの予備的観察をしているので、この詳細な理解をすることはDp40分子病態の理解に繋がるので今後の検討課題の一つに据える。
また、Dp40のみならず脳に高発現することが知られるDp71に関してもDp40分子機能との比較の観点から研究対象として新たに加える。
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