2015 年度実施状況報告書

免疫チェックポイント分子を標的とするキメラ抗原受容体遺伝子導入T細胞の新規開発

研究課題

研究課題/領域番号	15K09641
研究機関	新潟大学
研究代表者	今村勝新潟大学, 医歯学系, 助教 (80464006)
研究分担者	今井千速新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90419284)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	免疫チェックポイント分子 / キメラ抗原受容体 / 免疫細胞療法 / 腫瘍免疫
研究実績の概要	腫瘍免疫回避機構の克服に関して、近年免疫チェックポイント阻害療法が注目されている。これは腫瘍免疫抑制メカニズムを解除し、疲弊状態であった腫瘍免疫を再活性化させるものである。中でも活性化T細胞に発現するprogrammed-cell death-1 (PD-1)と腫瘍細胞が発現するPD-1リガンド（PD-L1）の結合を阻害するモノクローナル抗体療法は種々の難治性腫瘍に対して優れた臨床効果が認められている。本研究では、免疫チェックポイントに関わるリガンドに対するレセプターを用いて新規キメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor: CAR)遺伝子導入T細胞を作製し、難治性造血器・固形腫瘍に対する新しい治療法への臨床応用に展開するための基盤となる研究を行うものである。研究計画は以下の順序で進める予定である。①抗PD-L1/L2キメラ抗原受容体遺伝子の作製、②新規CAR遺伝子導入T細胞の作製及び腫瘍細胞に対する機能解析、③抗PD-1抗体: nibolumabによる新規CAR-T細胞の機能抑制の評価、④免疫不全マウスを用いた新規CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍効果の検討、⑤小児腫瘍におけるPD-L1/PD-L2の発現及び新規CAR-T細胞による抗腫瘍効果の検討。この内、平成27年度は①及び⑤の研究が進行している。CAR－T細胞は細胞外ドメイン、ヒンジ、細胞内ドメインのそれぞれの組み合わせにより抗腫瘍効果が異なる可能性があり、複数のPD-1 CAR遺伝子のコンストラクトを作成中である。これまでのPD-1研究の対象は主に成人腫瘍であったが、難治性小児腫瘍に対する新規治療の開発のためには小児腫瘍におけるPD-L1の発現を調べる必要があり、種々の腫瘍細胞株をフローサイトメトリー法で検討した結果、神経芽腫、骨肉腫に発現を認めた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由抗PD-L1/L2キメラ抗原受容体遺伝子の作製及びT細胞への遺伝子導入については、ヒトT細胞性白血病株Jurkat細胞からクローニングしたPD-1 cDNAを受容体として発現するようにシグナルペプチド、ヒンジ、膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内シグナルドメイン、CD3ζ細胞内シグナルドメインをSplice by overlap extension PCR (SOE-PCR)を用いてつなぎ合わせる予定であった。PD-1 cDNAをJurkat細胞からクローニングするのが難しく、最終的にPD-1 cDNAを購入した。それぞれのドメインを組み合わせた複数の遺伝子を作成するのに時間を要したが、これをMSCV-IRES-GFPレトロウイルスベクターのマルチクローニングサイトにサブクローニングした。小児腫瘍におけるPD-L1/PD-L2の発現及び新規CAR-T細胞による抗腫瘍効果の検討については、複数の腫瘍細胞株(骨肉腫5種、神経芽腫4種、横紋筋肉腫1種、急性骨髄性白血病4種、急性リンパ性白血病4種、子宮頸癌1種)上のPD-L1/PD-L2の発現を調べるのに時間を要した。
今後の研究の推進方策	抗PD-L1/L2キメラ抗原受容体遺伝子の作製及びT細胞への遺伝子導入については、まず発現ベクターをJurkat細胞に発現させフローサイトメトリー法にてPD-1蛋白発現を確認する。導入効率を確認後、ヒト末梢血単核球から分離したT細胞に遺伝子導入する。その後、複数の作成されたコンストラクトの細胞障害能を比較検討する。新規CAR-T細胞の機能解析する際の対象としては、これまでの研究結果よりPD-L1を発現していることが判明した神経芽腫、骨肉腫の細胞株を用いる。これらの腫瘍細胞株と新規CAR-T細胞を4時間共培養し、活性化マーカーとしてCD25、CD69の発現をフローサイトメトリー法で検討し、IL-2、IFNγ、GM-CSFをELISAにて測定する。また、細胞障害顆粒発現の評価としてグランザイムB、パーフォリン、CD107aの発現をフローサイトメトリー法で評価する。また、細胞障害活性の評価として、ルシフェラーゼ遺伝子導入したPD-L1陽性の腫瘍細胞株を96穴プレートに4時間付着させる。その後、新規CAR-T細胞を異なるEffector/Target ratioで4時間共培養する。Bright-Glo Assay System(Promega)を用いて生体発光をプレートリーダーで検出し、抗腫瘍効果を測定する。ここまでの実験で最も抗腫瘍効果が認められたCAR-T細胞を用いてnivolumabによる新規CAR-T細胞の機能抑制の評価や免疫不全マウスを用いた新規CAR-T細胞のin vivoでの抗腫瘍効果の検討を行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	新規CAR-T細胞のコンストラクト作成に時間を要したため、費用を要するインターロイキン2を用いた培養や、種々の機能解析などの実験が行えなかったため。
次年度使用額の使用計画	新規CAR遺伝子をヒト末梢血単核球から分離したT細胞に遺伝子導入する。その後、複数の作成されたコンストラクトの細胞障害能を比較検討する。腫瘍細胞株と新規CAR-T細胞を4時間共培養し、活性化マーカーとしてCD25、CD69の発現をフローサイトメトリー法で検討し、IL-2、IFNγ、GM-CSFをELISAにて測定する。また、細胞障害顆粒発現の評価としてグランザイムB、パーフォリン、CD107aの発現をフローサイトメトリー法で評価する。また、細胞障害活性の評価として、ルシフェラーゼ遺伝子導入したPD-L1陽性の腫瘍細胞株を96穴プレートに4時間付着させる。その後、新規CAR-T細胞を異なるEffector/Target ratioで4時間共培養する。Bright-Glo Assay System(Promega)を用いて生体発光をプレートリーダーで検出し、抗腫瘍効果を測定する。