| 研究課題/領域番号 |
15K09662
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
松井 英人 奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (00571027)
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| 研究分担者 |
杉本 充彦 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (80192128)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 血友病 / 遺伝子治療 / 細胞治療 / ベクター |
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| 研究実績の概要 |
一般にES細胞やiPS細胞等の未分化多能性幹細胞は、レンチウイルスベクター等による遺伝子導入効率が悪く、また導入した外来遺伝子の発現が維持できないサイレンシング現象がみられる。我々のiPS細胞におけるGFP遺伝子を導入した検討において、新規piggyBac ベクターはレンチウイルスベクターよりも遺伝子導入効率がよく、また導入された遺伝子のサイレンシングもかなり回避出来ることを見出している。これらについては、分泌されるFⅧ活性の長期持続性によって確認する。また血友病患者より樹立したiPS細胞へもFⅧ発現piggyBacベクターを導入し、FⅧの発現分泌を測定する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
FⅧは主に肝臓の類洞内皮細胞で産生されていることが知られている。FⅧは巨大なタンパク質で、切断や糖鎖修飾など、複雑な翻訳後修飾を経て、ER経路を経て分泌される。その為、未熟な多能性幹細胞よりも、ER経路がより発達した肝臓細胞や血管内皮系細胞の方が基本的にはFⅧの分泌が高いことが期待される。そこで、さらに優れたFⅧ産生細胞がないか検討するために、FⅧを恒常的に発現しているiPS細胞を、EB(胚様体)形成を経てランダムに三胚葉由来の細胞群へ分化させ、FⅧを高発現している細胞群を免疫染色後にソートし、ERマーカーや細胞表面マーカーから、どの様な細胞種においてFⅧの発現が高いか探索を行っているが、データが安定せず移植実験へ進むことが遅れた
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| 今後の研究の推進方策 |
血友病Aマウスモデルで細胞移植実験を行う。温度応答性細胞回収培養皿(セルシード社UpCell)を使いFⅧを発現する細胞シートを作製しマウスの皮下へ移植する。細胞シートは生体内移植後の機能的接着に有効であるとともに、外来性マトリックスを使用しないため移植に伴う炎症を少なく押さえることが可能である。 細胞移植実験後の治療効果は、①抗第Ⅷ因子抗体（インヒビター）産生量のELISA測定、生体内での免疫応答を確認するための②サイトカインアッセイ(IL-6 TNF-αなど)、③T細胞増殖試験、制御性T細胞誘導試験(FⅧ特異的制御性T細胞発現誘導の検討)などを行い、免疫寛容成立のメカニズムを詳細に検討する。また同時に、実験によって起こり得る副反応等も慎重に観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在細胞移植実験を継続中で、実験計画が全体的に遅れているため。
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