| 研究課題/領域番号 |
15K09667
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
早川 潤 日本医科大学, 医学部, 講師 (10386196)
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| 研究分担者 |
植田 高弘 日本医科大学, 医学部, 准教授 (20322505)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 脂肪由来間葉系幹細胞 / 骨髄不全症 / 造血支持組織 |
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| 研究実績の概要 |
まずはin vitroでの安定したマウス由来脂肪組織間葉系幹細胞の樹立を目指した。本プロジェクト２年目ではあるが、本年度もin vitroの実験に終始することになった。サイトカインの組み合わせ、培養液やMEDIUMの組成など変化させて組成を最適化することに努めたものの、どうしても骨への分化が優位になってしまい難渋してきた。本プロジェクトの肝になるところなので慎重に検討しているが、年度の後半からいままで他のプロジェクトで脂肪幹細胞を樹立し血管炎に関して研究してきた日本医科大学小児科大学院の内村僚一先生が我々の実験にも加わることになった。すでにマウス血管炎モデルに樹立した脂肪由来幹細胞を投与するプロジェクトに取り組んできており彼の樹立した実験系は安定していて本プロジェクトにも応用が利く事が予想された。また彼の評価系を使用することで移植後造血回復の時期の皮膚GVHDや血管炎をどの程度起こしてくるのか検討することができ興味深い。マウス大腿の脂肪を採取しコラゲナーゼ処理をしてから遠心分離をして沈殿物として残る部分の細胞を培養して間質細胞を得る方法を用いていたが、ようやくこの方法でマウス細胞から脂肪組織間葉系細胞が安定して樹立できるようになった。動物実験に関しては大学の実験動物倫理委員会講習を受講し、申請の資格を継続したが、in vitro実験の目処が立ってから実験計画書を提出し動物を搬入することにしているので2017年度中に申請することとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前述したように本プロジェクトを効率よく進めるにはいかにin vitroでの効率の良い脂肪由来間葉系細胞の樹立するかが不可欠である。我々の従来の培養系では骨細胞有意に分化誘導されてしまうことが多く、そこがボトルネックであった。2016年度の途中から我々のグループの植田が指導教官で別のプロジェクト（マウス間葉系細胞をもちいた川崎病血管炎モデルマウスの解析）を進めてきた大学院生の内村僚一先生が加わっったことにより、MEDIUMを最適化し、コラゲナーゼ処理をしてから遠心分離した細胞を使用する培養系で樹立したところ、ようやくマウス由来の細胞系は安定して脂肪幹細胞が樹立できるようになった。
大学の実験動物倫理委員会の事前講習は受講済みなので2017年度中には実験動物計画書を提出する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ようやく安定した脂肪組織由来骨髄幹細胞が樹立できるようになった。また動物実験に大学院生が加わることにより2017年度は動物実験に移行できると考えられる。GFPマウスを入手し、脂肪組織由来骨髄幹細胞を樹立。その後脂肪間葉系細胞を併用した骨髄細胞移植実験に着手する予定である。評価系には内村先生の血管炎モデルの解析法と同様に病理検体の免疫染色も実施したい。
またヒト臍帯血からの脂肪由来骨髄細胞のアッセイ系も確立して最終年度に予定するヒト化マウスを用いた移植実験に備えたい。
さらにもし造血不全症の患者が発生し、患者からの同意が得られたときには造血支持組織がどのような状態にあるかサイトカインアレーや造血コロニーアッセイで評価し最終的には造血不全症ヒト化モデルマウスを作成して脂肪組織由来細胞が移植時に有効であるか評価できるところまで検討できるようになれば本プロジェクトの目標は達成され、次期プロジェクトのseedsになると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
in vitroでの脂肪由来間葉系幹細胞の樹立に難渋したため、動物実験にかかる費用ならびに動物移植実験時に必要となるMACS beadsやフローサイトメーターや免疫染色で使用するための各種抗体の購入に必要な費用が未使用な状態であるため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
動物実験が開始されればとくにマウス購入費や細胞ソーティングに必要なMACS beads、各種抗体で経費がかなりかかると考えられ、順次使用していく方針である。
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