| 研究課題/領域番号 |
15K09676
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
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研究代表者 |
内山 徹 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, 室長 (10436107)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | baboon envelope / レンチウイルスベクター / ウイルス安定産生細胞株 |
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| 研究実績の概要 |
Baboon Envelopeは、細胞内ドメインをマウス白血病ウイルスに置き換えたBaEVTR、さらにそのC末端であるRペプチドを削除し細胞膜への融合を促進したBaEVRLessがある。293T細胞へのトランスフェクションによるレンチウイルス（LV）ベクターの産生では、BaEVTRおよびBaEVRLessとも高力価ウイルスの産生が可能であったが、BaEVRLessでは293T細胞への細胞毒性（細胞融合）が認められたことから、LV安定産生細胞株の作成にはBaEVTRを使用することとした。
当初の計画におけるバキュロウイルス―AAVベクターによるLVの構成遺伝子（gag-pol、rev）の導入は1コピーの遺伝子導入をなる可能性が高いことから、複数コピーの導入が可能である自己不活化型（SIN）レトロウイルス（RV）ベクターにより導入する方針とした。まず293細胞に対してSINRVによりLV-gag-polを導入し、puromycinでの選択後にクローニングを行った。RevおよびBaEVTR、LVベクタープラスミドのトランスフェクションで最も高い力価のウイルスを産生するクローン（293LVgp）を選択した。同様にRev遺伝子を導入し、neomycinによる選択後、BaEVTRとLVベクタープラスミドのトランスフェクションによりクローンを選択した（293gpr）。これまでの報告では、その細胞毒性からrevタンパクはtet-offなどの発現誘導が必要であったが、本研究では発現誘導を必要としないクローンを得ることが出来た。この293LVgprに対して、BaEVTRをSINベクターにて導入しhygromycinにて選択し、複数のクローンを得た。現在最も高力価のウイルス産生が可能なクローン（293LVgprBaEVTR）を選び出す作業を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定では、バキュロウイルス―AAVベクターにより、gag-polとrevを同一ベクターによって293T細胞に導入する予定であった。しかし、Rep78との組み合わせによるAAVS1サイトへの導入は、これらのウイルス構造遺伝子が1コピーの挿入となることから、高力価のウイルスが得られない可能性が考えられた。そのため、これまでにもLV産生細胞株の作成で報告のある、SIN-RVによる遺伝子導入へ変更した。SIN-RVでは複数コピーの遺伝子導入が可能となるが、一方でその挿入可能なサイズの制限からgag-polおよびrevを、別個のウイルスとして作成する必要があり、遺伝子導入及び選択の過程が増えることとなった。一方で、本研究においてウイルス産生細胞株を作成する際の最も大きな問題点は、revの細胞毒性と考えられるが、幸運にも発現誘導なくrev導入細胞株を作成できたため、以後の工程に関しては比較的順調に進めることが出来ると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
293Lvgprに対して、現在BaEVTRの導入を行っており、最も高力価のウイルスを産生するクローンを293LVgprBaEVTRとする。BaEVTRは細胞表面のASCT1とASCT2を受容体とする。そのため、これらを発現する様々な細胞に対し遺伝子導入を行い、その有用性を確認する。この細胞株は従来の方法と異なり、パッケージング細胞に対するベクタープラスミドのみでレンチウイルスベクターの作成が可能となることから、遺伝子治療のみでなく、一般の研究における遺伝子導入にも有効なツールとなり得る。
また、293LVgprBaEVTR作製後は、最終ステップとして、Wiskott-Aldrich症候群（WAS）およびX連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）に対するレンチウイルスベクタープラスミドをそれぞれ導入し、遺伝子治療への安定ウイルスベクター産生細胞株を作製する。これらを利用して、疾患モデルマウス（WASノックアウトマウス、X-SCIDマウス）に対して遺伝子治療を行い、二次移植も含めて、長期の有効性を検討する。
また、既に同意を得たWASまたはX-SCID患者から採取した造血幹細胞に対してこれらを利用した遺伝子導入を行い、その後NOD-Scid/γc-null（NOG）マウスに移植を行うことで、遺伝子導入した患者造血幹細胞の機能回復を確認する。
疾患モデルマウス、患者造血幹細胞とも機能解析として、①WAS：TCRシグナルを介したT細胞の増殖、B細胞による抗体産生、②X-SCID：T細胞、NK細胞の発生、B細胞の抗体産生、を解析することで、その有効性を判定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を行うに当たって、報告書にも記載した通り、予備研究において従来の方法による方法（バキュロウイルス-AAVハイブリッドベクターの使用）では、高力価のウイルス産生細胞の作製が難しい可能性が判明したため、方針を変更（自己不活化型レトロウイルスベクターの使用）する必要があった。結果新たな手法で問題点は解決されたため、初年度に行う予定であった研究内容を含めて次年度にて使用する予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の計画として、本年度に作製したパッケージング細胞（293LVgprBaEVTR）によりレンチウイルスベクターを作製し、臍帯血由来から免疫磁気ビーズにて分離したcD34陽性造血幹細胞に、サイトカインなどの様々な条件にて遺伝子導入を行う。本年度に行う予定であったこれらの研究に必要なサイトカイン、免疫磁気ビーズ、研究用臍帯血の購入に次年度使用額の研究費を使用する。その他、動物疾患モデルマウスの購入と飼育、サイトカイン、免疫磁気ビーズ、解析用の各種抗体の購入に翌年度助成金を使用する予定である。
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