| 研究課題/領域番号 |
15K09755
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
長田 真一 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00244484)
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| 研究分担者 |
能登 舞 秋田大学, 医学部, その他 (10738462)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞極性 / aPKC / 毛包幹細胞 / 休眠機構 / 毛包新生 / 創傷治癒 / プロテインキナーゼC / 脱毛 |
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| 研究実績の概要 |
私たちは、これまでに細胞極性制御因子であるaPKCλ(atypical protein kinase C lamda)を表皮細胞特異的に欠損させた変異マウスを解析し、aPKCλが毛包幹細胞の休眠状態を制御することによって、皮膚恒常性の維持に関わっていることを明らかにした。本研究では、この成果をさらに発展させ、aPKCによる毛包幹細胞の休眠制御、および創傷治癒後毛包新生に関わるシグナル経路を明らかにすることを目的とし、以下の研究計画を進めている。
①表皮から全aPKC分子種を欠損させた遺伝子改変マウスの作製：マウス表皮では、aPKCλ、aPKCζの2種のaPKCが発現している。両者の機能上の相補性を完全に除去し、皮膚恒常性維持におけるaPKCの役割を調べるために、aPKCλ･ζダブルノックアウトマウスの作製を目指している。その前段階として、aPKCλ、aPKCζがそれぞれ単独で欠損した遺伝子改変マウスの繁殖を進めた。
②毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング：進行性の脱毛をきたす表皮特異的aPKCλcKOマウスの表皮とコントロールマウスの表皮で発現が変化する遺伝子をマイクロアレイにより解析した。
③創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割：創傷は、毛包幹細胞を休眠状態から目覚めさせる刺激といえる。マウス背側皮膚に１cmx１cm大以上の傷を作ると、その治癒過程で創傷中央部に、Wnt 経路依存的に毛包の新生が観察される。この創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割を調べるために、コントロールマウス、表皮特異的aPKCλcKOマウス、aPKCζKOマウスマウスで解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①表皮から全aPKC分子種を欠損させた遺伝子改変マウスの作製：表皮特異的aPKCλcKOマウスとaPKCζKOマウスそれぞれのコロニーは順調に繁殖している。現在、両者を交配し、aPKCλ･ζダブルノックアウトマウス(DKO)の作製を目指している。
②毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング：生後23日目の休止期のコントロールマウス、および表皮特異的aPKCλcKOマウスの背側皮膚を採取し、RNAを抽出後cDNAを合成した。合成したcDNAをCy3, Cy5で蛍光ラベルし、マイクロアレイ解析を行い、cKOマウスで発現が２倍以上増減している遺伝子を網羅的に探索した。そのデータを基にパスウェイ解析を行った結果、２倍以上増減する遺伝子は、Focal Adhesion-PI3K- Akt-mTOR 経路、Chemokine経路、Cell cycle経路、Hedgehog経路、Toll-like receptor経路、Delta-Notch経路、Wnt経路、MAPK経路、TGFβ経路などを構成する要素であることが判明した。これまで毛包形成に関わることが報告されているHedgehog経路やWnt経路、表皮の極性形成に関与しているDelta-Notch系経路の構成成分が検出されたことは、この解析の正しさを示している。現在、増減を示した遺伝子の発現をreal-time PCRで検証している。
③創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割：コントロールマウス、表皮特異的aPKCλcKOマウスについては目安としていた２０匹の解析が終了した。aPKCζノックアウトマウスについては5匹の解析が終了した。
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| 今後の研究の推進方策 |
①表皮特異的λ･ζ DKOマウスの作成：引き続き交配を進め、aPKCλ･ζ DKO マウスを作製し、その表現型を解析する。
②毛包幹細胞の休眠シグナル経路に関わる因子の網羅的スクリーニング：パスウェイ解析により明らかになったシグナル経路について、コントロールマウスに較べ表皮特異的aPKCλcKOマウスで２倍以上の発現の増減を示した遺伝子について、real-time PCRで発現を検証する。また、増減を示した遺伝子が、aPKCλcKOマウスにおける脱毛の進行過程でどのような動態を示すか、real-time PCRや蛍光免疫染色法で解析する。
③創傷治癒後毛包新生におけるaPKCの役割：aPKCζKOマウスについても２０匹の解析を終わらせ、コントロールマウス、表皮特異的aPKCλcKOマウスの結果と比較する。また、可能であればaPKCλ･ζ DKO マウスでも創傷治癒後の毛包新生を解析する。毛包新生時にはWnt経路が活性化することが報告されているが、表皮特異的aPKCλcKOマウス、およびaPKCζKOマウスにおける毛包新生時にWnt経路が活性化されているのか、抑制されているのかreal-time PCRと蛍光免疫染色法で調べる。
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