| 研究課題/領域番号 |
15K09789
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
伊藤 宗成 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (20408371)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 人工多能性幹細胞 / 先天性表皮水疱症 / 遺伝子治療 / 細胞治療 |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度の到達目標は、①遺伝子相同組み換えを利用した、患者由来人工多能性幹細胞（iPSC）内での遺伝子変異の修復（遺伝子治療）、②遺伝子変異を修復したiPSCの表皮細胞（KC）、線維芽細胞（FB）、骨髄由来幹細胞（BMSC）への分化誘導であった。
鋳型DNAとCRISPR発現vectorを、Electroporationにて患者由来iPSCに導入し、薬剤耐性による選別にて相同組換えが生じた細胞株の取得を目指した。実験開始当初、目的の遺伝子変異が修復された細胞株は得られていなかった。これはElectroporationによる薬剤耐性遺伝子のrandom integrationや、CRISPRによる切断不備などが原因と考えられた。そのため、Electroporationの条件変更や、CRISPRによる遺伝子切断部位の選別を行ったところ、Direct Sequence法、Southern blot法の双方で、遺伝子変異の修復がなされていると確認された細胞株が獲得できた。現在、iPSC内の薬剤耐性遺伝子の除去を行っている。
また同時に、遺伝子変異の修復された細胞株をKC、FB、BMSCに分化させることで、実際に欠損していた7型コラーゲンの生成の有無を確認している。確立済みの分化方法を用いてKC、FBへの分化を試みているが、残念ながらKCへの分化がうまくいっていない。これは細胞株の個体差に寄るものが大きいと考えている。分化方法確立時のiPSCは、retroviusにてFBから樹立したものであったが、現在のiPSCは、Sendai virusにてT細胞から樹立したものである。そのため、現行の分化方法に修正を加え、KCの効率的な分化を目指しているところである。FBの分化は順調に進んでおり、7型コラーゲンの発現確認に用いる予定である。BMSCへの分化についてはまだ着手し始めたところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定と比較すると若干の遅れを感じるが、これはやはり遺伝子変異の修復という非常に困難なミッションに時間が費やされたためと思われる。遅れた要因として、人的要素や経済的要素、エフォートの低下は考えていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
無事に遺伝子修復されたと思われる細胞株が獲得されたため、今後は分化実験が推進されていくものと思われる。KCへの分化がうまくいっていないことは懸念材料である。しかし共同研究者による近年の報告によると、先天性表皮水疱症の治療に対するBMSC（間葉系幹細胞）の有用性が示されている。そのため、KCやFBへの分化誘導はあくまで7型コラーゲンの発現を確認するために行い、BMSCへの分化実験にシフトすることも検討している。また、当大学再生医学研究部の他グループにて、iPSCから間葉系幹細胞の分化実験が行われており、そのノウハウを活かすことができるものと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度にも研究物品の購入計画が多数あったため、次年度にも使用できる範囲内と思われる端数分は次年度繰り越しとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度も研究の遂行には多額の研究費が必要であり、細胞培養などに用いる消耗品購入に充てる予定である。
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