認知症に関連する細胞内異常蓄積蛋白の分解過程におけるリン酸化の影響

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K09828
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 田中 稔久 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (10294068)
• 研究分担者: 森原 剛史 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90403196)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: タウ蛋白 / TDP-43 / リン酸化

研究実績の概要

タウ蛋白とTDP-43の分解過程における基質リン酸化の影響を検討した。
タウ蛋白の336-340 QVEVQ配列および347-351 KDRVQ配列がタウのシャペロン介在性オートファジー（CMA）分解に必須と考えられている。そこでこの部位を欠損した変異タウ蛋白（Δ226-351）を作成した。そして、ラット肝臓由来のライソゾームにリコンビナントタウ蛋白（野生型および変異型）を添加してインキュベートし、取り込まれたタウレベルを検討したところ、野生型タウはライソゾームに取り込まれ、変異タウ蛋白（Δ226-351）は少量しか取り込まれなかった。そして、プロテインキナーゼA（PKA）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK-3）によってそれぞれの蛋白をリン酸化したところ、PKAによってリン酸化された野生型タウのライソゾームへの取り込みは亢進した。
シャペロン量の変化がCMAの速度を規定しているという仮説に沿って、培養細胞にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を添加し、ヒートショック蛋白群の発現の変化を検討したところ、HSP10の発現亢進が認められた。
TDP-43をCaspaseにより分解すると42kDa、35kDa、25kDaのフラグメントが出現する。TDP-43の病的リン酸化部位をリン酸化することが知られているカゼインキナーゼ-1（CK-1）を用いてTDP-43をリン酸化し、これをin vitroにおいてCaspaseにより分解したところ、非リン酸化TDP-43と同様のフラグメントが産生された。これと結合するXIAPを検討したところ、35kDaフラグメントに相当するものだけがリン酸化の有無にかかわらず結合した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

TDP-43蛋白に関する検討は、リコンビナント蛋白を抽出する過程で凝集性が強く、抽出に時間がかかったため、初年度に遅れが生じていた。しかし、コールドショック蛋白発現系を用いることで蛋白を抽出することができた。

今後の研究の推進方策

（今後の推進方策）
タウ蛋白のCMAによる分解過程に関しては、変異タウ蛋白（Δ336-351）および野生型タウ蛋白を培養細胞に強制発現させ、その分解過程を追跡し、キナーゼ活性化剤および阻害剤を添加して、CMAによるタウの分解の変化を検討する。また、タウ蛋白およびTDP－43蛋白の分解に関して、ユビキチン化を介する過程を検討する。

次年度使用額が生じた理由

初年度にリコンビナントTDP－43蛋白の抽出に難航したため、研究に遅れが生じた。

次年度使用額の使用計画

リコンビナントTDP－43蛋白に関する実験を最終年度に集中して行う。

研究成果

• [雑誌論文] Sleep disturbances are key symptoms of very early stage Alzheimer disease with behavioral and psychological symptoms: a Japan multi-center cross-sectional study (J-BIRD). (2016)
  • 著者名/発表者名: Kabeshita Y, Adachi H, Matsushita M, Kanemoto H, Sato S, Suzuki Y, Yoshiyama K, Shimomura T, Yoshida T, Shimizu H, Matsumoto T, Mori T, Kashibayashi T, Tanaka H, Hatada Y, Hashimoto M, Nishio Y, Komori K, Tanaka T, Yokoyama K, Tanimukai S, Ikeda M, Takeda M, Mori E, Kudo T, Kazui H.
  • 雑誌名: Int J Geriatr Psychiatry. 巻: 32 ページ: 222-230
  • DOI: 10.1002/gps.4470.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional connectivity assessed by resting state EEG correlates with cognitive decline of Alzheimer's disease - An eLORETA study－ (2016)
  • 著者名/発表者名: Hata M, Kazui H, Tanaka T, Ishii R, Leonides C, Pasqual-Marqui RD, Aoki Y, Ikeda S, Kanemooto H, Yoshiyama K, Iwase M,, Takeda M.
  • 雑誌名: Clin Neurophysiol. 巻: 127 ページ: 1269-1278
  • DOI: 10.1016/j.clinph.2015.10.030.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association between high biomarker probability of Alzheimer's disease and improvement of clinical outcomes after shunt surgery in patients with idiopathic normal pressure hydrocephalus. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kazui H, Kanemoto H, Yoshiyama K, Kishima H, Suzuki Y, Sato S, Suehiro T, Azuma S1), Yoshimine T, Tanaka T.
  • 雑誌名: J Neurol Sci. 巻: 369 ページ: 236-241
  • DOI: 10.1016/j.jns.2016.08.040.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Differences of Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia in Disease Severity in Four Major Dementias. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kazui H, Yoshiyama K, Kanemoto H, Suzuki Y, Sato S, Hashimoto M, Ikeda M, Tanaka H, Hatada Y, Matsushita M, Nishio Y, Mori E, Tanimukai S, Komori K, Yoshida T, Shimizu H, Matsumoto T, Mori T, Kashibayashi T, Yokoyama K, Shimomura T, Kabeshita Y, Adachi H, Tanaka T.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: １１ ページ: e016109
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0161092.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 認知機能低下に対する薬物療法―根治的治療薬開発の現状 (2016)
  • 著者名/発表者名: 田中稔久
  • 雑誌名: 臨床精神薬理 巻: 19 ページ: 101-108
  • 査読あり
• [学会発表] タウの分子病理と治療薬開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 田中稔久
  • 学会等名: 第39回日本神経科学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2016-07-20 – 2016-07-22
  • 招待講演