| 研究課題/領域番号 |
15K10007
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 講師 (30524243)
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| 研究分担者 |
小川 良平 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (60334736)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | がんがん幹細胞 / プロテインスプライシング / FRET / イメージング |
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| 研究実績の概要 |
がん幹細胞は，正常組織中に存在する幹細胞同様に，自己複製能と多分化能を併せ持つ腫瘍組織内の未分化な細胞である。この細胞は低酸素領域に存在することと，低い細胞分裂頻度，また高いDNA修復能のため，DNAを標的とする放射線や抗癌剤治療に対し抵抗性を示す。このため，治療後に残存し腫瘍の再発，転移の原因として問題視されている。これら問題解決のアプローチとして我々は，生体腫瘍内低酸素領域で誘導される細胞死を非侵襲的，かつリアルタイムに可視化するシステムの構築を目的とした。これまでに，我々は低酸素応答因子（HIF）を応用した低酸素応答アポトーシス可視化システムを構築し低酸素細胞アポトーシスのリアルタイム可視化に成功している。しかし，近年，HIFが活性化していない，より低酸素な腫瘍領域内にがん幹細胞が存在していることを示唆する報告もあり，構築した低酸素応答アポトーシス可視化システムを用いがん幹細胞アポトーシスを可視化するには限界がある。つまり，がん幹細胞に対する殺細胞効果を評価するには，生体腫瘍内におけるがん幹細胞そのものの分布とそのアポトーシスを可視化する新たなシステムを構築する必要がある。このシステム構築のため，今年度，我々はがん幹細胞アポトーシス可視化システムにおいて要である２断片化したGFPの再構成方法の検討および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を応用したアポトーシス細胞可視化システムの検討を試みた。その結果，GFPの再構成に関しては，プロテインスプライシングを応用することでGFPの蛍光強度上昇を確認し，その再構成に成功した。FRETを応用したアポトーシス細胞可視化に関しては，抗がん剤を添加したアポトーシス細胞群と非添加細胞群で2種の蛍光波長の割合が異なることを確認した。しかし、その蛍光強度は低く，今後の生体腫瘍実験を見据え，高い蛍光強度を有するシステムへの改良が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
プロテインスプライシングとは，ポリペプチドのインテインが取り除かれエクステインが連結する反応過程である。幹細胞特異的に発現がみられるKlf4，Oct3/4とSox2等の転写因子で，エクステインを付加した2分割GFP断片の発現をそれぞれ制御することで，がん幹細胞のみでGFPの再構成がおこなわれ，がん幹細胞を蛍光細胞としてイメージングすることが可能となる。アポトーシス細胞の可視化にはFRETを応用したシステムを用いる。GFPとRFPをカスパーゼ３の基質となるプロテアーゼ認識配列DEVDを含むリンカーで繋いだアポトーシスFRETプローブは，通常，483 nmの励起した場合，GFPからRFPへのFRETが起こりRFPの蛍光波長である584 nmの蛍光が検出される。これに対し，活性型カスパーゼ３によりリンカーペプチドが切断されるとFRETが2分子間で起こらずGFPの蛍光波長である506 nmの蛍光が検出される。つまりアポトーシス細胞と非アポトーシス細胞を緑色と橙色，異なる蛍光色を持つ細胞としてイメージングすることが可能となる。現在までに，エクステイン配列をGFP２断片遺伝子配列に付加したプラスミド，またアポトーシスFRETプローブをコードしたプラスミド，さらに上記２つの特性を付与したプラスミド構築をおこない，その機能評価をおこなった。その結果，プロテインスプライシングは機能し，２断片化したGFPの細胞内再構成に成功した。またアポトーシスFRETプローブを用い，抗がん剤を添加したアポトーシス細胞群と非添加細胞群を比較した結果，２種の蛍光波長の割合が異なることをフローサイトメトリー解析により確認した。しかし，２つの特性を付与したプラスミドを遺伝子導入した細胞はアポトーシスFRETプローブのみをコードしたプラスミドを遺伝子導入した細胞と比較し，GFP，RFP共に発光強度の低下が観察された。
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| 今後の研究の推進方策 |
構築した２つの特性を併せ持つがん幹細胞アポトーシス可視化システムを，マウスを用いた生体腫瘍実験へ応用した場合，蛍光強度が低いため，がん幹細胞およびそのアポトーシスを検出することは難しいと予測される。２断片化しないGFPの蛍光強度と比較し，２断片化し再構成されたGFPの蛍光強度は低い。励起エネルギーはGFPからRFPへFRETを介しエネルギー移動が起こるため，再構成された蛍光強度の低いGFPのFRET効率は悪く，その結果，RFPの蛍光強度低下を引き起こすとも考えられる。この問題解決のため，我々はGFP内の２断片化する位置やアミノ酸残基変更等の調整をおこない高い蛍光強度を有する再構成GFPの検討をおこなう予定である。また，幹細胞特異的転写因子を介し２断片GFP発現を制御するため，CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用い，幹細胞特異的転写因子で制御される遺伝子下流に，上記で構築したがん幹細胞アポトーシス可視化システムをノックインした安定発現株を構築し，その蛍光特性を評価する予定である。これら安定発現株を播種した担癌マウスを作製し，がん組織内におけるがん幹細胞の分布とそのアポトーシスを可視化し，がん幹細胞を標的とした新規薬剤の探索をおこなう予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は，プロテインスプライシングを応用したがん幹細胞可視化システム，およびがん幹細胞アポトーシス可視化システムを構築し，このシステムをCRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用い，特定遺伝子下流にノックインするまでを予定していた。既に上記２つのシステムを１つに併せたプラスミドは完成しているが，低い発光強度のため，CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いた次の実験ステップへ移行できていない。このため，CRISPR/Cas9ゲノム編集技術に必要な試薬，および可視化システムの蛍光特性評価に使用予定であった試薬等を購入する必要がなく，使用額に差が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
引き続き，高い蛍光強度を有する再構成GFP構築方法の検討をおこなう。また，ゲノム編集技術を用い，このシステムを特定遺伝子下流に挿入した安定発現株構築を目指す。構築確認後は，研究計画調書に従い，in vitroにおける構築システムの蛍光特性評価を行い，この安定発現株をマウスに播種した担癌マウスを用い，生体腫瘍内がん幹細胞およびそのアポトーシスの非侵襲的リアルタイム可視化実験に移行する予定である。
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