研究課題
CHO細胞とCHO細胞を親株とするDNA-PK欠損株（非相同末端結合欠損株）、Rad51欠損株（相同組換え欠損株）を用いて重粒子線を照射し、DNA二本鎖切断の指標であるリン酸化型ヒストンH2AXのフォーカス数の経時的変化を調べたところ、X線を照射したときと同様に、DNA-PK欠損株では、親株や相同組換え欠損株に比べてDNA修復の速度が遅いことを見いだした。また、ヒト正常繊維芽細胞においても、相同組換えが機能しない静止期の細胞と、対数増殖期の細胞とでDNA修復の速度に大きな差がなかった。このことは、X線と同様に、重粒子線照射後のDNA二本鎖切断修復に、主に非相同末端結合が関与していることを示唆している。また、これと並行して重粒子線照射後のDNA二本鎖切断部位にDNA-PK、53BP1、Rif1など非相同末端結合に関与するタンパク質が局在していること、リン酸化型DNA-PKのフォーカス数の経時的変化と、リン酸化型ヒストンH2AXのフォーカス数の経時的変化が類似していることを見いだした。一方、昨年度までに、CHO細胞とその変異株を用いた生存率の解析結果では、重粒子線特有のRBEの増加は相同組換えに依存していることが明らかになっている。また、複数の細胞種を用いて各種修復タンパク質の局在を調べたところ、X線照射では少なくとも一部のDNA二本鎖切断において非相同末端結合と相同組換えが競合的に機能しているのに対して、重粒子線ではより相同組換え反応が促進されているという結果が得られていた。以上の結果から、重粒子線により生じるDNA二本鎖切断は主に非相同末端結合により修復されるが、一部の重篤な損傷は相同組換えでのみ修復可能であり、それが細胞の生存率に影響を与えていることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
本研究では、重粒子線照射後のDNA二本鎖切断修復過程を分子レベルで明らかにすることを目的としており、蛍光抗体法を用いた修復タンパク質の細胞内における局在変化や、DNA二本鎖切断の修復過程の経時変化の解析、DNA修復タンパク質の欠損株を用いた遺伝学的解析から、重粒子線照射後の修復反応における非相同末端結合と相同組換えのそれぞれの役割を示唆する結果が得られた。一方、突然変異率を指標とした重粒子線治療のリスク評価については、施設の都合で十分な実験回数が得られなかったため、期間を延長して来年度以降に解析を行う予定である。
重粒子線照射後のDNA修復過程の概要が明らかになったので、今後は、重粒子線のエネルギーと修復過程の違いについて解析し、DNA損傷の重篤度が修復経路の選択に与える影響を調べる。また、重粒子線治療におけるリスク評価のため、重粒子線照射後の突然変異率について引き続き解析する予定である。
今年度は、DNA修復経路の解析と突然変異率の解析のために、それぞれ６回程度の照射実験を予定していたが、照射施設の都合（修理とメンテナンスのための中断、他の実験グループとの運転時間の競合等）により実験回数が９回にとどまり、突然変異率の解析について再現性を確認できなかったため次年度に繰り越した。
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RIKEN Accel. Prog. Rep.
巻: 51 ページ: in press
J. Biol. Chem.
巻: 292 ページ: 13008-13021
0.1074/jbc.M117.779371
