| 研究課題/領域番号 |
15K10022
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| 研究機関 | 愛知県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
羽根田 正隆 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍免疫学部, 研究員 (50436995)
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| 研究分担者 |
小林 孝彰 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70314010) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 形質細胞 / siRNA / 遺伝子導入 / 抗ドナー抗体 |
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| 研究実績の概要 |
目的：抗ドナー特異的抗体産生形質細胞のみをターゲットとした抗体産生抑制効果がえられるsiRNAを作成する事を最終目的とするが、ターゲットが少量である事や抗ドナー抗体を産生する形質細胞のみでは研究を行うには少量すぎて効果判定が難しいため、抗ドナー抗体の相補性決定領域(CDR;complementary detemining region)をターゲットとしてsiRNAを作成するのではなく、抗体の基本骨格であるフレームワーク領域(FR:framework region)をターゲットとしてsiRNAを作成し、siRNAの抗体産生抑制効果を検討することとした。
方法：ヒト末梢血中の形質細胞をミルテニー社のWhole Blood CD138 マイクロビーズkitを用いて採取し、短期間培養を行いIgG1およびIgM特異的産生形質細胞数をELISPOT assayにて判定した。この培養系に対して、IgG1およびIgMのFR特異的なsiRNAを設計、作成し、核酸導入を行い、抗体産生細胞数の減少率を検討した。
結果および考察：昨年度に続きsiRNA transfection試薬の選定に難渋しており、現在、形質細胞へ安定的に遺伝子導入できる試薬の選定を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
SuperFect Transfection ReagentおよびPAMAMデンドリマーを用いた遺伝子移入を試みた。しかしながら、どちらの試薬においても、遺伝子移入が十分される濃度では形質細胞に対する細胞毒性が観察された。形質細胞は抗体を大量に産生できるタンパク質工場のように分化した細胞であり、タンパク質の品質管理が厳密に行われている。その為、細胞外からの刺激に対しては敏感に反応がおこり、細胞傷害がより強く出ている可能性がある。
形質細胞に対するsiRNA遺伝子移入の方法はまだ確立されたものが無いが、他の細胞でPAMAMデンドリマーと同時にをPEG化することにより、細胞毒性を減少できるといった報告があるため、現在試薬の選定を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
PAMAMデンドリマーの側鎖数3あるいは４を用いて、siRNAを遺伝子導入する研究報告がみられた（Int. J. Pharm. 485 (2015) 261、 Int. J. Pharm. 485 (2015) 288.）。これに従い遺伝子移入を試みたが、遺伝子移入が十分される濃度ではコントロールsiRNAでも細胞毒性が観察された。PAMAMデンドリマーをPEG化することにより、細胞毒性を減少できるといった報告があり、現在試薬の選定を行っている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由)研究の進捗に遅れがており、それに合わせて計画遂行のために必要な物品の購入に滞りが生じた。
（使用計画）形質細胞へのsiRNA導入を安定的に行う必要があり、そのための試薬の選定に難渋している。形質細胞は抗体を大量に産生できるタンパク質工場のように分化した細胞であり、タンパク質の品質管理が厳密に行われている。その為、細胞外からの刺激に対しては敏感に反応し、細胞傷害がより強く出ている可能性がある。
形質細胞に対するsiRNA遺伝子移入の方法はまだ確立されたものが無いが、他の細胞においてPAMAMデンドリマーと同時にをPEG化することにより、細胞毒性を減少できるといった報告があるため、これらの試薬を購入し安定的な形質細胞へのsiRNA導入を行う予定である。
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