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平成30年度は研究実施計画における、①マウス肝外胆管幹/前駆細胞の遺伝子発現解析と肝幹前駆細胞との遺伝子発現の比較、②in vitro での肝組織幹/前駆細胞を用いた肝様細胞の作成、至適培養条件の検討、機能解析、③in vitro での肝外胆管幹/前駆細胞を用いた胆管構築ための培養条件の検討、を行った。
マウス肝幹/前駆細胞の分離培養技術をすでに確立しているが、肝外胆管系であるマウス胆嚢からも、同様の方法で6か月以上継代可能、かつ凍結保存可能な上皮様細胞の分離培養に成功した。これが前駆細胞の性質を持っているか上記の肝幹/前駆細胞と比較検討した。RT-PCRの手法を用いた発現遺伝子の解析では、胆嚢上皮由来前駆細胞よりαフェトプロテイン、アルブミン、サイトケラチン19等、内胚葉系未分化マーカーの発現を確認しており、少なくとも肝前駆細胞類似の性質をもつ内胚葉系譜の細胞集団が含まれることを確認した。さらに免疫染色でも上記蛋白の発現を確認した。
肝前駆細胞の肝細胞への分化誘導法について、spheroid 形成によって、アルブミン等、肝細胞マーカーの発現レベルが上昇することを確認した。しかしながら、分離細胞株により分化のレベルや分化誘導のし易さが異なることが確認された。
胆嚢上皮由来前駆細胞と肝前駆細胞の共培養で上記のspheroidと連続する構造を形成させるためには、胆嚢上皮由来前駆細胞も肝細胞系譜への分化ができなければならないと考えているが、胆嚢上皮由来前駆細胞は肝前駆細胞と全くおなじ分化誘導の条件では十分な分化は得られないことが分かった。播種細胞密度も分化に大きく影響することがわかった。胆嚢上皮由来前駆細胞を用いて3 次元培養を行い、極性をもった管腔構造を形成するための最適な培養条件を検討した。
また、上記で検討している肝前駆細胞は培養条件により膵β細胞系譜へ分化することが確認され、当研究室より論文報告を行った。
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