| 研究課題/領域番号 |
15K10173
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
矢永 勝彦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (70220176)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 肝虚血再灌流障害 / マイトファジー / Parkin / ミトコンドリア / アデノウイルスベクター |
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| 研究実績の概要 |
本研究は肝切除術または肝臓移植における虚血再灌流障害について、マイトファジーに焦点をあて、その機構を解明するものである。さらにマイトファジーのイニシエーターであるParkinを導入することにより、虚血再灌流傷害の新たな予防法を証明する。本研究は細胞培養実験および動物実験において検証され、実証された結果は将来的に臨床研究への応用を目標とするトランスレーショナルスタディである。本研究の最大の特色は肝虚血再灌流傷害におけるParkinとマイトファジーに関する機構を世界で初めて明らかにすることである。さらにPARK2への介入による虚血再灌流傷害の軽減策も世界初の試みとなる。オートファジーと肝虚血再灌流傷害との関係は過去にいくつか報告があるものの、いずれもオートファジー亢進の最下流を確認するにとどまっており、本質は未解明なままである。
我々はマウスを用いた虚血再灌流モデルを作成し、Parkinと虚血再灌流障害との関係を評価する。また初代幹細胞を樹立し、疑似的な虚血再灌流モデルを作成し、In vitroでのメカニズムを解明する。またアデノウイルスベクターを用いてPARK2遺伝子を導入し、Parkin強制発現による効果を検証する。またPARK2ノックアウトマウスを用いて同様に遺伝子導入し、メカニズムの解明を行う。
現時点では実験に必要な学内各種委員会の承認を得た。In vivoにおける虚血再灌流モデルの作成、および肝障害の評価を行った。またPARK2ノックアウトマウスの繁殖を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本学の動物実験委員会の承認を得て実験を開始した。C57BL/6jマウスを用いて虚血再灌流モデルを作成した。マウスは麻酔科に開腹し血管クリップを用いて左様及び中葉を選択的に血流遮断し（70%虚血）、任意の時間経過後に血管クリップを外して再灌流した。再灌流後は0時間から48時間まで経時的な評価を行った。阻血時間は20分、30分、60分に設定し、条件検討を行った。再灌流後の肝障害を肝逸脱酵素、アポトーシス関連タンパク（Cytochrome C, Celaved Caspase 9, Cleaved PARP)、病理学的評価、電子顕微鏡にて行った。再灌流後は1時間より急激に肝逸脱酵素の上昇を認め、6時間後をピークに漸減する傾向を認めた。同様にアポトーシス関連タンパクは再灌流1-6時間後の発現が最も強く、その後漸減した。HE染色では60分虚血では再灌流後1時間より出血性変化を認め、その後壊死領域が拡大した。電子顕微鏡による評価では膨化したミトコンドリアを観察した。20分虚血の病理評価では軽度の出血性変化は認めたものの壊死性変化を認めなかった。Parkinの変化は再灌流後24時間以降に発現の増強を認め、アポトーシスと相反する挙動を示した。一方、PARK2ノックアウトマウスであるB6.129S4-Park2(tm1Shn)/Jを、現在繁殖中である。
In vitroでは窒素を用いた低酸素環境を整備し、現在安定した初代肝細胞の樹立を目指している。
本学の遺伝子組み換え委員会の承認を得て、アデノウイルスベクターの構造を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進方策は当初研究方針から多きな変更はない。変更点としてはPARK2遺伝子をノックダウンするのではなく、ノックアウトマウスを用いる点である。
オートファジーおよびParkin発現が虚血再灌流保護的な働きをしていることを示す。
またマイトファジー阻害によるアポトーシス評価を行う。マイトファジー阻害剤(mdivi 1)を用いてin vitro, in vivoにおけるマイトファジーの減衰を確認し、虚血再灌流傷害後のアポトーシスの評価および細胞活性を評価する。同時にPARK２ノックダウンマウスを用いて評価する。
PARK2導入アデノウイルスベクターを作成する。In vitro, in vivoにおいてPARK2遺伝子を導入し、マイトファジーの亢進を評価アデノウイルスベクターを用いてPARK2遺伝子を導入4し、Parkinの強制発現を確認する。Parkin強制発現によるマイトファジーの亢進を確認する。Parkin強制発現させてマイトファジーを亢進させ、虚血再灌流障害におけるアポトーシスの低減を示す。またPARK2ノックダウンマウスにもPARK2を導入し虚血再灌流障害の軽減効果を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は電子顕微鏡における評価および遺伝子発現の評価、アデノウイルスベクターの作成を行わなかった。当該評価にかかる予定であった助成金額が次年度に使用する予定となる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記理由に基づき電子顕微鏡における評価および遺伝子発現の評価、アデノウイルスベクターの作成を行う。当該実験に前年度助成金額を執行する予定である。
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