胆汁分泌小胞中miRNAの解析による胆管癌の早期診断マーカーの開発

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K10194
• 研究機関: 大阪市立大学
• 研究代表者: 竹村 茂一 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00322363)
• 研究分担者: 南山 幸子 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00362989) ; 久保 正二 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (80221224)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 胆道癌 / 胆汁 / 印刷業 / バイオマーカー

研究実績の概要

肝胆膵癌においてERCPや術中に採取した胆汁のレドックス動態、脂質過酸化物などを測定するとともに患者（印刷業従事胆管癌を含む）胆汁中の細胞外小胞中のmiRNAを解析し、これらを組み合わせることによって独自の早期診断マーカーを探索し、予後不良の胆管癌の早期発見、減少に貢献することを目的とする。
平成27年度（初年度）は印刷従事者胆管癌4例、印刷業以外の肝胆膵癌43例、非担癌症例14例から採取した胆汁について酸化還元動態、変異原性試験、胆汁酸組成を検討した。印刷業従事者とそれ以外の胆管癌の胆汁をHPLC 法により電化化学検出器（クーロケム）で解析した結果を比較すると、印刷業で酸化型グルタチオンの割合が高く、胆汁酸組成では二次胆汁酸が高いことが判明した。印刷業の胆管癌症例では発癌時点ですでに有機溶媒暴露の中止から長期間経過しているため、化学物質の影響は考えにくく、病理組織像を勘案すると薬剤により過去に惹起された胆管炎の遷延あるいはその結果を反映していると考えられた。全症例において変異原性試験は陰性であった。
平成28年度（本年度）は、胆道癌症例及び非胆道癌症例より術中に採取した胆汁を用いてエクソソームの回収を試みた。胆汁中のエクソソームは想定通り微量であり、従来法での精製は困難であった。しかしながら、新規の回収法を開発（詳細は諸事情のため不記載）することができ、エクソソームの確認を行った。エクソソーム中からは、胆管癌特異的miRNAの候補を確認している。今後、本手法を用いてさらなる収量の増加に取り組むとともに、胆管癌特異的なマーカーの解析を行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

初年度に予定していた肝胆膵癌患者における胆汁のレドックス動態をHPLC-ECD法での解析は順調に集積でき解析できた。印刷従事者を含む胆道癌症例と非担癌症例ともに変異原性試験では全例陰性であった。胆道癌の新たなバイオマーカーを検出するための胆汁中エクソソームの回収は非常に困難であるためその精製は困難であった。実際、他の研究者においても、現時点でLing Liらによる報告（Hepatology 2014;60:896-907）を含め数編しか見られない。これは、エクソソーム回収に際して、胆汁のpHの影響や、非常にRNAが微量であること、など特殊な要因が関与するためで、我々も当初は通常のRNAシークエンサー法では種々の条件検討を行ったが回収は不可能であったため、研究の進捗がやや遅れた。諸事情により詳細は記載できないが、新たに開発した手法により得られた胆汁中エクソソーム分画よりmiRNAをリードすることができ、現在、症例数を増やし解析を続けている。

今後の研究の推進方策

当初予定した胆道癌に特異性の高いバイオマーカーを検出するために考案した胆汁を用いた解析法のうち、酸化ストレス関連の検討ならびに変異原性試験については順当に終了した。胆汁中のエクソソーム内miRNAの解析について、従来困難であった胆汁中のエクソソームの新規精製法を確立することができた。現在、エクソソーム分画から得たmiRNAの収量を高める手法を考案し、得られたmiRNAプロファイルより胆道癌特異的な変動を検出する予定である。

次年度使用額が生じた理由

胆汁よりのエクソソームの精製のためには新規解析手法を講じざるを得ず、その考案ならびに条件検討のため必要な試薬の発注が一部遅れたためです。

次年度使用額の使用計画

昨年中に新規の解析方法の確立ができたため、本年度には多数例の検索を行う予定です。それに伴い物品費の増加が想定されるため、予定通りの経費を必要とする予定です。

研究成果

• [雑誌論文] Questionnaire survey on work motivations of gastrointestinal and hepatobiliary pancreatic surgeons enrolled in a Japanese national interdisciplinary program. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaibori M, Nitta H, Hayashi M, Takemura S, Nagano H, Matsui K, Ikoma H, Nakai T, Yasunaga M, Kido M, Aoki T, Rikiyama T, Sano K, Kudo A, Katagiri S, Otsuka Y, Kuroki T, Nomi T, Yano K, Endo I, Ueno M, Kanazawa A, et al.
  • 雑誌名: J Hepatobiliary Pancreat Sci. 巻: 23 ページ: 697-702
  • DOI: 10.1002/jhbp.392
  • 査読あり
• [雑誌論文] Outcomes of Hepatic Resection in Intrahepatic Cholangiocarcinoma Patients with Diabetes, Hypertension, and Dyslipidemia: Significance of Routine Follow-Up. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nishioka T, Kubo S, Tanaka S, Wakasa K, Takemura S, Kinoshita M, Hamano G, Kuwae Y, Shibata T, Suehiro S.
  • 雑誌名: Liver Cancer 巻: 5 ページ: 107-120
  • DOI: 10.1002/jhbp.392
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased FGF19 copy number is frequently detected in hepatocellular carcinoma with a complete response after sorafenib treatment. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaibori M, Sakai K, Ishizaki M, Matsushima H, De Velasco MA, Matsui K, Iida H, Kitade H, Kwon AH, Nagano H, Wada H, Haji S, Tsukamoto T, Kanazawa A, Takeda Y, Takemura S, Kubo S, Nishio K.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 23 ページ: 49091-49098
  • DOI: 10.18632/oncotarget.10077
  • 査読あり
• [雑誌論文] Outcomes after resection of occupational cholangiocarcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Shinkawa H, Kinoshita M, Hamano G, Ito T, Koda M, Aota T, Yamamoto T, Terajima H, Tachiyama G, Yamada T, Nakamori S, Arimoto A, Fujikawa M, Tomimaru Y, Sugawara Y, Nakagawa K, Unno M, Mizuguchi T, Takenaka K, et al.
  • 雑誌名: J Hepatobiliary Pancreat Sci. 巻: 23 ページ: 556-564
  • DOI: 10.1002/jhbp.373
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hypermutation and unique mutational signatures of occupational cholangiocarcinoma in printing workers exposed to haloalkanes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Mimaki S, Totsuka Y, Suzuki Y, Nakai C, Goto M, Kojima M, Arakawa H, Takemura S, Tanaka S, Marubashi S, Kinoshita M, Matsuda T, Shibata T, Nakagama H, Ochiai A, Kubo S, Nakamori S, Esumi H, Tsuchihara K.
  • 雑誌名: Carcinogenesis 巻: 37 ページ: 817-826
  • DOI: 10.1093/carcin/bgw066
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparison of clinicopathological characteristics between patients with occupational and non-occupational intrahepatic cholangiocarcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hamano G, Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Shinkawa H, Kinoshita M, Ito T, Yamamoto T, Wakasa K, Shibata T.
  • 雑誌名: J Hepatobiliary Pancreat Sci. 巻: 23 ページ: 389-396
  • DOI: 10.1002/jhbp.353
  • 査読あり
• [雑誌論文] The association between non-alcoholic steatohepatitis and intrahepatic cholangiocarcinoma: A hospital based case-control study. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita M, Kubo S, Tanaka S, Takemura S, Nishioka T, Hamano G, Ito T, Tanaka S, Ohsawa M, Shibata T.
  • 雑誌名: J Surg Oncol. 巻: 113 ページ: 779-783
  • DOI: 10.1002/jso.24223
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pathological spectrum of bile duct lesions from chronic bile duct injury to invasive cholangiocarcinoma corresponding to bile duct imaging findings of occupational cholangiocarcinoma. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita M, Kubo S, Nakanuma Y, Sato Y, Takemura S, Tanaka S, Hamano G, Ito T, Terajima H, Yamada T, Nakamori S, Arimoto A, Fujikawa M, Sugawara Y, Yamamoto T, Abue M, Nakagawa K, Unno M, Mizuguchi T, Takenaka K, Shirabe K, Shibata T.
  • 雑誌名: J Hepatobiliary Pancreat Sci. 巻: 23 ページ: 92-101
  • DOI: 002/jhbp.305
  • 査読あり
• [雑誌論文] Outcomes of laparoscopic hepatic resection versus percutaneous radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma located at the liver surface: A case-control study with propensity score matching. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ito T, Tanaka S, Iwai S, Takemura S, Hagihara A, Uchida-Kobayashi S, Shinkawa H, Nishioka T, Kawada N, Kubo S.
  • 雑誌名: Hepatol Res. 巻: 46 ページ: 565-574
  • DOI: 10.1111/hepr.12592
  • 査読あり
• [雑誌論文] Screening and surveillance for occupational cholangiocarcinoma in workers exposed to organic solvents. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Nishioka T, Kinoshita M, Hamano G, Ito T, Yamamoto T, Abue M, Aoki M, Nakagawa K, Hijioka S, Miyamoto A, Osaki Y, Endo G, Kumagai S.
  • 雑誌名: Surg Today. 巻: 46 ページ: 705-712
  • DOI: 10.1007/s00595-015-1229-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] MicroRNA expression in hepatocellular carcinoma after the eradication of chronic hepatitis virus C infection using interferon therapy. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tamori A, Murakami Y, Kubo S, Itami S, Uchida-Kobayashi S, Morikawa H, Enomoto M, Takemura S, Tanahashi T, Taguchi YH, Kawada N.
  • 雑誌名: Hepatol Res. 巻: 46 ページ: 26-35
  • DOI: 10.1111/hepr.12518.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 新しい職業がんの発症とその予防 職業性胆管癌の臨床的特徴 (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保 正二(大阪市立大学 大学院肝胆膵外科学), 竹村 茂一, 田中 肖吾, 新川 寛二, 西岡 孝芳, 木下 正彦, 濱野 玄弥, 伊藤 得路, 中沼 安二, 圓藤 吟史
  • 雑誌名: 日本職業・災害医学会会誌 巻: 64 ページ: 1-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【肝内胆管癌の新しい規約と治療戦略】 肝内胆管癌の疫学的動向と危険因子 (2016)
  • 著者名/発表者名: 久保 正二, 竹村 茂一, 田中 肖吾, 新川 寛二, 木下 正彦, 濱野 玄弥, 伊藤 得路, 青田 尚哲, 江田 将樹, 上西 崇弘
  • 雑誌名: 外科 巻: 78 ページ: 115-121
  • 査読あり
• [学会発表] 職業性胆管癌の手術成績 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下正彦，竹村茂一，田中肖吾，新川寛二，濱野玄弥，伊藤得路，江田将樹，青田尚哲，久保正二
  • 学会等名: 第14回日本消化器外科学会大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2016-11-05 – 2016-11-05
• [学会発表] 職業性肝内胆管癌と非職業性肝内胆管癌との臨床病理学的比較 (2016)
  • 著者名/発表者名: 濱野玄弥，竹村茂一，田中肖吾，新川寛二，木下正彦，伊藤得路，青田尚哲，江田将樹，山本隆嗣，久保正二
  • 学会等名: 第71回日本消化器外科学会総会
  • 発表場所: あわぎんホール、アスティ徳島(徳島件徳島市）
  • 年月日: 2016-07-14 – 2016-07-14
• [学会発表] 肝切除症例からみた肝内胆管癌と非アルコール性脂肪性肝炎の関連性 (2016)
  • 著者名/発表者名: 木下正彦，竹村茂一，田中肖吾，濱野玄弥，伊藤得路，江田将樹，青田尚哲，田中さやか，大澤政彦，久保正二
  • 学会等名: 第71回日本消化器外科学会総会
  • 発表場所: あわぎんホール、アスティ徳島(徳島件徳島市）
  • 年月日: 2016-07-14 – 2016-07-14
• [学会発表] 胆道癌に対するDUPAN-Ⅱ測定の有効性について (2016)
  • 著者名/発表者名: 伊藤得路，竹村茂一，田中肖吾，木下正彦，濱野玄弥，青田尚哲，石原 敦，新川寛二，久保正二
  • 学会等名: 第71回日本消化器外科学会総会
  • 発表場所: あわぎんホール、アスティ徳島(徳島件徳島市）
  • 年月日: 2016-07-14 – 2016-07-14
• [学会発表] Development of cholangiocarcinoma in a printing company employee: Occupational cholangiocarcinoma (2016)
  • 著者名/発表者名: Kubo S, Takemura S, Tanaka S, Kinoshita M, Hamano G, Nakanuma Y, Sato Y, Mimaki S, Tsuchihara K
  • 学会等名: The 7th Asia-Pacific Primary Liver Cancer Expert Meeting
  • 発表場所: Hong Kong （China)
  • 年月日: 2016-07-09 – 2016-07-09
  • 国際学会