| 研究課題/領域番号 |
15K10339
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
長嶺 英樹 琉球大学, 医学部, その他 (30573331)
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| 研究分担者 |
片桐 千秋 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00443664)
石内 勝吾 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10312878)
菅原 健一 琉球大学, 医学部附属病院, 講師 (50375573)
渡邉 孝 琉球大学, 医学部附属病院, 講師 (90573337)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脳腫瘍 / グリオブラストーマ / 高気圧酸素療法 / HBO / 低酸素 |
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| 研究実績の概要 |
グリオブラストーマ細胞株を異種移植した腫瘍における網羅的遺伝子解析の結果、放射線単独照射群と高気圧酸素療法併用群で相反した遺伝子についてTet-ON Advanced systemを用いた薬剤依存的高発現細胞株の樹立に着手した。まずTet-ON3Gタンパク質発現細胞株を得るため、U87-MG細胞にpEF1-Tet3Gプラスミドをトランスフェクションし、G418による薬剤選択により数系統の細胞株を樹立した。発現量解析の結果、相反した２遺伝子をそれぞれTREプロモーターの下流に挿入したプラスミドを構築するためそれぞれの遺伝子をPCRによりクローニングし配列を確認した。得られた遺伝子配列を、TREプロモーター配列の下流に組み込んだプラスミドを構築した。完成した２遺伝子のプラスミドをそれぞれ樹立した細胞株にトランスフェクションしたのち、薬剤選択にてそれぞれの遺伝子におけるTet-ON細胞株を樹立途中である。
並行してグリオブラストーマ細胞株をスフェロイド培養するための条件検討を行った。増殖因子のEGFおよびNGFの濃度を変化させて至適濃度を決めた。培養条件により作成したスフェロイドを細胞用高気圧酸素チャンバーに入れ、培養時間および気圧を変化させ酸素化度をピモニダゾール処理と抗ハイポキシプローブ抗体を用いて検討している。スフェロイドの組織染色はパラフィン固定に難航し、固定化の条件検討に時間を費やした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に計画していた、高発現細胞株の樹立において、遺伝子クローニングとプラスミドの構築は順調に進み、Tet-ON3Gタンパク質発現細胞株は樹立した。TREプロモーターの下流にそれぞれの遺伝子を組み込んだプラスミドを樹立した細胞にトランスフェクションし樹立間近であるため。また、細胞用高気圧チャンバーの条件検討およびスフェロイド細胞魂の組織染色法についても至適条件をつかむことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
H28年度は樹立した高発現細胞株のテトラサイクリンによる発現検討を行い、高発現、低発現株を決定しスフェロイド培養およびヌードマウスへの異種移植を行い検討する。具体的には(1)樹立した細胞をスフェロイド培養し通常酸素および高気圧酸素環境にて培養し酸素化度、放射線感受性を検討、(2)樹立した細胞をヌードマウスの臀部皮下に異種移植し放射線療法を行う際にテトラサイクリンをマウスに投与し放射線感受性への影響を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
組織染色用の抗体を購入しようとしたが、当該年度内に納入が不可能となったため次年度の会計にて購入することになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
購入予定だった抗体を購入する。
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